Здесь мы описываем доставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 в мышиной модели нервно-мышечных заболеваний. Один периферийных администрации в мышах привели к устойчивой Мирна гиперэкспрессия в мышцы и двигательных нейронов, обеспечивая возможность для изучения Мирна функции и терапевтический потенциал в vivo.
Система РНК-интерференции по дорожке эндогенного Мирна регулирует экспрессии генов, контролируя синтез белков через post-transcriptional генов. В последние годы Мирна опосредованной гена регулирование показал потенциал для лечения неврологических расстройств, вызванных токсичными усиления функции механизма. Однако эффективные доставке в тканях-мишенях ограничивает его применение. Здесь мы использовали модель трансгенные мыши для позвоночника и бульбарной мышечной атрофии (SBMA), нервно-мышечные заболевания вызваны Хантингтона экспансии в андрогена (AR), чтобы проверить сайленсинга генов недавно выявленных AR-ориентация Мирна, мир-298. Мы оверэкспрессировали мир-298-с помощью рекомбинантной аденоассоциированный вирус (rAAV) вектор серотип 9 для облегчения трансдукция-деления клеток. Одной инъекции хвост вен в SBMA мышей индуцированной постоянной и широко распространенной гиперэкспрессия мир-298 в скелетных мышцах и двигательных нейронов и привели к мелиорации нервно фенотип в мышей.
Интерферирующим некодирующих РНК, 21-23 нуклеотидов в длину, которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов и контроля различных клеточных и метаболических путей. 1 экспрессии генов главным образом регулируется вызывая деградации глушителей или мРНК post-transcriptional ген. 2 адаптивной, обычно дополняют 3′ непереведенные региона (утр) кодирование генов, хотя привязка к 5′ УТР и Кодирующие области целевого объекта, который также был описан мРНК. 3
Как нынешнее понимание роли микроРНК в патогенезе заболеваний человека расширяется, фармакологические модуляции отдельных адаптивной или Мирна семей становится все более жизнеспособным вариантом терапевтических. По сравнению с другими стратегиями ингибирование РНК, адаптивной имеют много преимуществ: интерферирующим менее токсичны и менее иммуногенность и могут быть легко доставлены в клетки из-за их малого размера. 4 , 5 , 6 интерферирующим обычно имеют много целей в пределах сотовой сети, поэтому потенциальные эффекты пробить и проблемы безопасности, которые необходимо принять во внимание, наряду с эффективной доставки в тканях-мишенях.
Нервно-мышечных заболеваний приобретенных или унаследовали условия, которые влияют на мышцы и двигательных нейронов. Направленные против наркотиков в скелетных мышцах является новой областью исследований, где главной задачей является достижение широкого распространения в пределах терапевтического окна. 7 моторные нейроны являются более трудно ориентированы, главным образом потому, что препарат доступа исключается гематоэнцефалический барьер.
В этом исследовании были использованы клетки культуры и мыши модели спинного мозга и бульбарной мышечной атрофии (SBMA). SBMA является нервно-мышечные заболевания, вызванные токсичных усиления функции механизма, в котором затрагиваются мышечные и двигательных нейронов. 8 , 9 SBMA (Кеннеди болезни; Маккусика #313200) — Х-хромосомой заболевание, характеризующееся мышечная слабость и атрофия, вызванные CAG повторить расширения в AR ген, который кодирует расширенный Хантингтона тракта в AR белка. 10 не болезнь модифицирующие лечение в настоящее время доступна для этого расстройства. Трансгенные мыши модель, используемая в настоящем исследовании резюмирует особенности заболевания, в том числе гендерной специфики, патологии двигательного нейрона и прогрессивная мышечная атрофия. 11
В этом исследовании, наши усилия сосредоточены на выявлении Мирна, непосредственно результате выражение мутант трансген AR и на разработке безопасной и эффективной режим доставки Мирна спинного и скелетных мышцах нашей модели мыши болезни.
Здесь мы определили относительно uncharacterized miRNA, Мирна-298 (присоединение номер MIMAT0004901),12 непосредственно сократить мутант AR выражение в SBMA модели. Для того, чтобы обеспечить доставку мир-298 в тканях-мишенях, мы использовали вирусный стратегию, с рекомбинантным аденоассоциированный вирус серотипа 9 (rAAV9). rAAV9 способен через гематоэнцефалический барьер и посредническая долгосрочный экспрессии генов-деления клеток, включая нейронов. 13 единого системного администрирования AAV9-мир-298 привели к устойчивой выражение Мирна, эффективной трансдукции мышц и двигательных нейронов, вниз регулирование AR выражения и улучшении фенотип болезни в SBMA мышей. 14 эта методология может использоваться для предоставления Мирна или antagomirs гиперэкспрессия в естественных условиях.
Здесь мы показываем, высоко эффективной и доступной методологии для выбора и доставить через хвост инъекции Мирна с использованием rAAV9 как вирусный вектор целевого скелетных мышц и двигательных нейронов у мышей. 14 по сравнению с другими стратегиями интерференции, адаптивной, менее токсичных и менее иммуногенность. 18 Кроме того, их небольшой размер делает их хорошо подходят для упаковки ограниченного потенциала вирусных векторов. 2 вычислительных алгоритмов и предсказание инструменты позволяют идентифицировать предполагаемый Мирна мРНК-мишеней. После того, как определены, эффекты Мирна на экспрессию генов цели должны быть проверены. Общий подход заключается в overexpress данного микроРНК в пробирке и выявления целевых уровнях выражения протеина с использованием западных анализа. 14 , 19
Различные исследования использовали вирусный и не вирусной стратегии для доставки адаптивной. 13 здесь мы использовали аденоассоциированный вирус (AAV) как средство доставки генов. По сравнению с другими вирусных векторов, Аав вызывает низкой иммуногенностью, позволяет долгосрочного переноса генов, и имеет широкий спектр тропизм в делящихся и -деления клетки. 18 этот метод доставки также можно обойти необходимость химической модификации, которые могут повлиять на функциональность и специфичность молекулы РНК. Есть несколько серотипов AAV, которые главным образом определяются состав капсульных белков. Эти серотипов отличаются в их тропизма и передают различных типов клеток. Необходимо выбрать правильный серотип при рассмотрении ткани-мишени. Мы выбрали rAAV9, благодаря своей высокой электромеханической эффективности в центральной нервной системе и скелетных мышц, после периферийных администрации19,20. Этот подход показал большую эффективность трансдукции новорожденных животных, по сравнению с взрослых животных, скорее всего, из-за различий в составе внеклеточного матрикса, соотношение нейронов и глии и зрелость blood-brain барьер. 21 , 22
Важным шагом в этом протоколе является дизайн вектора выражения. По сравнению с bicistronic векторов, которые сдерживаются ниже выражение гена второй, по сравнению с первый ген рядом с промоутером, двойной промоутер вектор позволяет спина к спине конфигурации, таким образом давая высокое выражение Мирна и EGFP, позволяя локализации микроРНК в ткани мыши, иммунофлюоресценции.
Внутривенные инъекции AAV9 привело к высокой эффективности и однородной трансдукции в тканях-мишенях, скелетных мышц и двигательных нейронов. Этот маршрут инъекции позволяет введенной дозы для достижения кровообращения и пересечь гематоэнцефалический барьер крови, которая имеет важное значение для терапии против центральной нервной системы. Кроме того это неинвазивный метод для доставки в ЦНС. Мир-298 выражение увеличилась в спинной мозг и мышцы после 2-4 недель с одной периферийных инъекции в возрасте 5 недель. Когда с помощью одноцепочечной генома векторы AAV, de novo синтез второй нити ДНК может объясняться задержкой трансдукции. 23
Уровни человеческого мир-298 были обнаружить в обработанных мышей 20 недель после однократного применения, предполагая, что для лечения хронических заболеваний, множественные инъекции могут потребоваться для достижения терапевтический эффект. Однако Мирна деградации с течением времени может иметь ограничения при необходимости непрерывного неоднократные администрации. Кроме того адаптивный иммунитет к векторы AAV могут образовываться еще одним препятствием для успешного гена доставки. 24 таким образом поколение векторы AAV, которые являются иммунологически инертными имеет решающее значение для повторных администрации и достижения долгосрочных эффектов с этой перспективной системы доставки. 25
Ограничение на использование Мирна как терапевтические стратегии является риск-целевого воздействия. Интерферирующим могут взаимодействовать через incomplementary низкопробный спаривать с другими транскрипты гена, который создает угрозу безопасности с этим подходом. Проектирование RNAi последовательностей, включая использование неканонических адаптивной, таких как mirtrons, который обойти комплекс микро процессором и обширную долгосрочную безопасность и переносимость исследования важны прежде чем переводить эту стратегию в безопасное и эффективной терапии. 26 , 27 , 28
Метод, описанный здесь первоначально был разработан для гиперэкспрессия Мирна, но он также может использоваться для Мирна ингибирование терапии с использованием antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Авторы заявляют никакого конфликта интересов. Мы благодарим SignaGen лаборатории (Rockvile, MD, США) для производства вирус AAV9. Это исследование было поддержано очной программе исследований NINDS, низ. Филипп р. ли был поддержан средств от отдела интрамуральных исследований NICHD. Карло Ринальди был поддержан стипендий от французской ассоциации contre les миопатии (АСМ).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |