Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.
A análise de impurezas de proteína de baixo nível (1-100 ppm) (por exemplo, célula hospedeira proteínas (HCPs)) em proteína biotherapeutics é um ensaio desafiador que requerem alta sensibilidade e uma ampla faixa dinâmica. Ensaios de quantificação de espectrometria de massa base para proteínas normalmente envolvem a digestão de proteínas, seguido pela reação reação seletiva múltipla/monitoramento monitoramento quantificação (SRM/MRM) de peptídeos usando uma baixa resolução em tandem (Rs ~ 1.000) espectrômetro de massa quadrupolo. Uma das limitações desta abordagem é o fenômeno de interferência observado quando o peptídeo de interesse tem o “mesmo” precursor e fragmento de massa (em termos de valores m/z) como outros peptídeos co eluição presentes na amostra (dentro de uma janela de 1-Da). Para evitar este fenômeno, propomos uma abordagem alternativa de espectrometria de massa, um ensaio MRM de alta seletividade (HS) que combina a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo com o de alta resolução (~ 30.000 Rs) MS deteção de fragmentos de peptídeo. Nós exploramos os recursos desta abordagem para quantificar padrões de baixa abundância peptídeo cravado em digerir um anticorpo monoclonal (mAb) e demonstrou que tem a sensibilidade e o alcance dinâmico (pelo menos 3 ordens de magnitude) normalmente alcançado no HCP análise. Todos os seis padrões de peptídeo foram detectados em concentrações tão baixas quanto 0.1 nM (1 femtomole carregado em uma coluna cromatográfica de 2,1 mm ID) na presença de um fundo de alta-abundância de peptídeo (2 µ g de uma digest carregado de mAb na coluna). Quando se considera o MW de fosforilase coelho (97,2 kDa), de que derivam os peptídeos cravados, o LOQ deste teste é inferior a 50 ppm. Desvios-padrão relativos (RSD) das áreas de pico (n = 4 repetições) foram menos de 15% em toda a gama de toda concentração investigada (0,1-100 nM ou 1-1.000 ppm) neste estudo.
Quantificação de grandes biomoléculas (proteínas) em ambientes industriais é atualmente baseada em imunoensaios (por exemplo, ELISA), principalmente devido a diversas vantagens: sensibilidade, alta produtividade, facilidade de uso e baixo custo por amostra. Quando aplicado para analisar as impurezas de abundância de baixa proteína (1-100 ppm de proteínas da célula hospedeira (HCPs)) presentes na terapêutica de proteína, estes ensaios biológicos normalmente fornecem a concentração total do HCP (geralmente expressada em ppm ou ng mAb HCP/mg), mas eles Não consigo identificar e medir contaminantes individuais do HCP. Vários ensaios baseados em MS recentemente têm sido desenvolvidos para complementar o ELISA ou forneça informações que Elisa não oferecem1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. por causa da complexidade da amostra e a exigência para detectar peptídeos HCP através de uma ampla faixa dinâmica em concentração (pelo menos 3 ordens de magnitude), métodos cromatográficos multidimensionais, fracionamento de amostra extensa de concurso têm tradicionalmente foi empregado para ajudar a identificar a baixa abundância HCPs1,2,3,4,5,6,7.
Um natural passo seguinte HCP identificação e validação é rastreamento HCP (monitoramento) entre vários lotes de produtos biofarmacêuticos. Nesta situação, os métodos de LC/MS de dimensão única têm sido propostos para melhorar a taxa de transferência de amostra8,9. No entanto, a precisão e alcance dinâmico do HCP medições podem ser afetadas em um ensaio de LC/MS 1D pela esmagadora presença de peptídeos biofarmacêutica. Comparado a uma separação multidimensional, o potencial de interferência sinal19,20,21,de22 é aumentado em uma separação cromatográfica de dimensão única porque a probabilidade de precursores de peptídeo mais ser co eluição é aumentada. A incorporação de meios ortogonais para a separação de precursores de peptídeo sem estender o tempo de separação cromatográfica claramente seria vantajosa. Viajar de mobilidade (TWIM) íon onda10 tem a capacidade de resolver espectros de MS congestionados em milissegundos. Aproximadamente 500 separações de mobilidade podem ser executadas durante a eluição de um peptídeo único, assumindo uma largura do pico cromatográfico completo de 10 s e considerando-se que o tempo de execução de uma separação de IM do instrumento de mobilidade do íon é 20 ms.
Espectrometria de massa ensaios para quantificação de proteína foram desenvolvidos com sucesso nas últimas década usando o bem aceita selecionado (vários) reação monitoramento abordagem (método SRM/MRM) implementada em tandem espectrómetros de massa11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Uma das limitações deste teste baixa resolução e espectrometria de massa é a interferência fenômeno19,20,21,22 observada quando o peptídeo de interesse tem o “mesmo” precursor e fragmento de massa como outros peptídeos co eluição presentes na amostra (dentro de uma janela de 1-Da). Há duas maneiras para melhorar a precisão dos métodos SRM/MRM: uma opção envolve uma etapa extra de separação ao nível do precursor para remover íons interferentes de precursor, enquanto a outra opção é aumentar a resolução MS da detecção de precursor/fragmento Evite a sobreposição de MS de sinais. O modo de aquisição de MRM (HS) alta seletividade descrito aqui tira proveito de ambas essas abordagens pelo acoplamento a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo com o de alta resolução (~ 30.000 Rs) MS deteção de fragmentos de peptídeo. O ensaio descrito aqui capas de pelo menos três ordens de magnitude, que é a gama dinâmica normalmente observadas em SRM/MRM proteomics experimentos17,18,24.
O utilitário do ensaio HS-MRM para quantificação de HCP foi demonstrado pelo monitoramento a linearidade do sinal produzido por seis padrões de peptídeo cravados em diferentes concentrações (faixa de 0,1 a 100 nM) em digerir um anticorpo monoclonal.
De alta resolução (Rs > 20.000) espectrometria de massa é usada rotineiramente para caracterização estrutural de proteínas terapêuticas em uma variedade de plataformas de instrumento. Em contraste, quantificação de proteína baseada em MS é normalmente realizada por SRM/MRM em baixa resolução (Rs ~ 1.000) em tandem quadrupolo espectrómetros de massa usando assinatura peptides gerados pela clivagem enzimática de proteínas11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. como separações cromatográficas de dimensão única não podem resolver totalmente as misturas do complexo peptídeo produzidas por digestão enzimática, eluição co peptídeo é uma ocorrência comum, mesmo no caso de um único-proteína digest. Para digere proteína muito complexa (por exemplo, para a quantificação de 1-100 ppm de HCPs na presença de um fundo rico em peptídeos produzidos pela proteína terapêutica), a sensibilidade, exatidão ou linearidade da SRM/MRM ensaio pode ser afetado por interferência.
Os ensaios SRM/MRM têm seletividade unidimensional, contando apenas com uma combinação de “exclusiva” de massas precursor/fragmento. Por esta razão, estes ensaios falharem em situações quando o fundo de peptídeo muda inesperadamente (por exemplo, para amostras de Biofarmacêutica obtidos de processos de purificação diferentes). Para superar essas limitações, propomos aqui um ensaio de alta seletividade (HS) MRM implementado em um íon habilitados para mobilidade de alta resolução quadrupolo tempo-de-voo (QTOF) híbrido espectrômetro de massa (para o diagrama do instrumento, veja a Figura 6).
O instrumento separa os precursores do peptide do interesse de outros precursores de peptídeo co eluição (interferência) na célula de mobilidade do íon, isola o envelope cheio isotópico do precursor no quadrupolo e fragmentos-lo com um CE fixo na célula de colisão. O sinal produzido por seu fragmento de peptídeo mais abundante é reforçado, ajustando a frequência de empurrador (realce de destino), que seletivamente empurra massa regiões de interesse para o tubo de voo, em vez de todos os íons, como com uma varredura completa. Quantificação de peptídeo é executada usando os sinais de alta-MS-resolução (Rs ~ 30.000) produzidos por este íon fragmento. Em comparação com os ensaios SRM/MRM, o ensaio de HS-MRM oferece dois níveis adicionais de seletividade: é fornecida pela separação de mobilidade do íon precursor-nível, enquanto o segundo é oferecido pela resolução massa aumentada do analisador TOF. Os resultados trazidos por estas melhorias de seletividade são visíveis os cromatogramas de HS-MRM exibidos na Figura 7, que são livres de interferências através de três ordens de magnitude.
Ao contrário dos ensaios SRM/MRM, existem vários parâmetros que podem ser ajustados para otimizar os ensaios de HS-MRM: a janela de RT em torno do precursor do peptídeo (normalmente definida em 0,2 min), a janela de isolamento de quadrupolo (4 Da), a janela de tempo de deriva em torno a precursor (± FWHM do pico do precursor do mobilogram de íon correspondente) e a resolução MS do íon fragmento (20.000-40.000). Os ensaios de HS-MRM são muito sensíveis: o montante mais baixo detectado para cada peptídeos PHO é 1 femtomole na coluna (ou 0.1 nM em termos de concentração de peptídeo). Quando se considera o peptídeo MW (ver tabela 1 para MWs precisos), a quantidade detectada na coluna é da ordem de 1-2-pg, enquanto que a coluna é carregada com uma quantidade significativamente maior (2 µ g) de peptídeos de fundo do mAb digest.
Tendo em conta o peso molecular da proteína PHO completo (97,2 kDa) de que derivam os peptídeos cravados, o ensaio é capaz de detectar 50 ppm de uma impureza de proteína na presença de íons de alta-abundância de fundo. Mais baixos limites de detecção (5-10 ppm) são realizáveis para menor peso molecular HCPs (10-20 kDa). O ensaio abrange três ordens de magnitude (conforme as curvas de calibração da Figura 8), o que significa que pode medir HCPs na faixa de 1-1.000 ppm. Também, a reprodutibilidade dos ensaios HS-MRM, ilustrado na tabela 3, combina muito bem com a reprodutibilidade dos ensaios SRM/MRM pequeno-molécula, com a área do pico RSD melhor do que 15%.
Nós explorou os recursos de um ensaio de romance para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em digerir um anticorpo monoclonal (mAb) e demonstrou a sua sensibilidade e utilidade para cobrir a ampla faixa dinâmica (pelo menos três ordens de magnitude) normalmente encontradas na análise do HCP. Todos os seis padrões de peptídeo foram detectados em concentrações tão baixas quanto 0.1 nM (1 femtomole carregado em uma coluna cromatográfica de 2,1 mm ID) na presença de um fundo de alta-abundância de peptídeo (2 µ g de uma digest carregado de mAb na coluna). Incorporando ambos HRMS alvo e separação de precursor de mobilidade do íon, o ensaio de HS-MRM tem um grande potencial para tornar-se um ensaio de controlo rápido, de alta produtividade para múltiplos HCPs através de vários lotes de produtos biofarmacêuticos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria agradecer Lesley Malouin e Tony Catlin de águas Corporation para a preparação de figura 6 do manuscrito.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |