Qui, descriviamo un’analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.
L’analisi delle impurità di proteina di basso livello (1-100 ppm) (ad es., proteine di cellula ospite (HCP)) nella proteina biotherapeutics è un test impegnativo che richiedono alta sensibilità e un’ampia gamma dinamica. Saggi di quantificazione basati sulla spettrometria di massa per proteine tipicamente coinvolgono la digestione delle proteine seguita dalla reazione di monitoraggio/multiple della reazione selettiva monitoraggio quantificazione (SRM/MRM) dei peptidi usando un tandem (Rs ~ 1.000) a bassa risoluzione spettrometro di massa Quadrupole. Uno dei limiti di questo approccio è il fenomeno di interferenza osservato quando il peptide di interesse è la “stessa” precursore e la massa di frammento (in termini di valori m/z) come altri peptidi co-eluizione presente nel campione (all’interno di una finestra di 1-Da). Per evitare questo fenomeno, proponiamo un approccio alternativo di spettrometrico di massa, un saggio MRM alta selettività (HS) che combina la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide con l’alta risoluzione (Rs ~ 30.000) MS rilevamento di frammenti peptidici. Abbiamo esplorato le funzionalità di questo approccio per quantificare gli standard di basso-abbondanza peptide spillo in un digest di anticorpo monoclonale (mAb) e ha dimostrato che ha la sensibilità e la gamma dinamica (almeno 3 ordini di grandezza) tipicamente realizzato in HCP analisi. Tutti e sei gli standard del peptide sono stati rilevati alle concentrazioni basse quanto 0.1 nM (1 femtomole caricato su una colonna cromatografica di 2,1 mm ID) in presenza di uno sfondo di alta-abbondanza peptide (2 µ g di un digest caricato mAb in colonna). Quando si considera il MW della fosforilasi coniglio (97,2 kDa), da cui sono stati derivati i peptidi a spillo, LOQ di questo test è inferiore a 50 ppm. Le deviazioni standard relative (RSD) delle aree dei picchi (n = 4 ripetizioni) erano meno del 15% su tutta la gamma intera concentrazione studiata (0.1-100 nM o 1-1.000 ppm) in questo studio.
Quantificazione di grande biomolecole (proteine) in ambienti industriali è attualmente basata su test immunologici (ad es., Elisa), principalmente a causa di diversi vantaggi: sensibilità, ad alta produttività, facilità d’uso e basso costo per campione. Quando viene applicata per analizzare le impurità di basso-abbondanza di proteine (1-100 ppm di proteine della cellula ospite (HCP)) presenti in terapie proteiche, questi saggi biologici in genere forniscono la concentrazione totale di HCP (solitamente espressa in ppm o ng mAb HCP/mg), ma essi non è possibile identificare e misurare i singoli contaminanti HCP. Diversi saggi basati su MS sono stati recentemente sviluppati per integrare ELISAs o per fornire informazioni che Elisa non riesce a offrire1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. a causa della complessità del campione e l’obbligo di rilevare peptidi HCP attraverso una gamma dinamica ampia concentrazione (almeno 3 ordini di grandezza), i metodi cromatografici multidimensionali frazionamento vasto campione di gara hanno tradizionalmente impiegata per aiutare a identificare il basso-abbondanza HCPs1,2,3,4,5,6,7.
Un naturale passo seguito HCP identificazione e convalida è rilevamento di HCP (monitoraggio) attraverso più batch di biofarmaci. In questo caso, metodi di singolo-dimensione LC/MS sono state proposte per migliorare la velocità effettiva del campione8,9. Tuttavia, la precisione e misurazioni gamma dinamica di HCP possono essere influenzati in un’analisi di LC/MS 1D dalla presenza schiacciante di biofarmaceutica peptidi. Rispetto ad una separazione multidimensionale, il potenziale per segnale interferenza19,20,21,22 è aumentato in una separazione cromatografica di singolo-dimensione perché la probabilità di più precursori del peptide di essere co-eluizione è aumentato. L’incorporazione dei mezzi ortogonali per la separazione dei precursori del peptide senza estendere il tempo di separazione cromatografica sarebbe chiaramente vantaggiosa. Viaggiare onda dello ione mobilità (TWIM)10 ha la capacità di risolvere congestionate MS spettri in millisecondi. Circa 500 separazioni di mobilità possono essere eseguite durante l’eluizione di un singolo peptide, assumendo una larghezza del picco cromatografico pieno di 10 s e considerando che il runtime di una separazione IM dello strumento di mobilità dello ione è 20 ms.
Analisi di spettrometrihe di massa per quantificazione della proteina sono state sviluppate con successo nel corso degli ultimi decennio utilizzando ben accettato selezionato monitoraggio approccio (metodo SRM/MRM) implementato su tandem spettrometri di massa11, della reazione (multipli) 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Uno dei limiti di questa analisi di spettrometria di massa a bassa risoluzione è interferenza fenomeno19,20,21,22 osservato quando il peptide di interesse è la “stessa” precursore e frammento di massa come gli altri peptidi co-eluizione presentano nel campione (all’interno di una finestra di 1-Da). Ci sono due modi per migliorare la precisione dei metodi SRM/MRM: un’opzione comporta un passaggio supplementare separazione a livello di precursore per rimuovere gli ioni interferenti di precursore, mentre l’altra opzione è quello di aumentare la risoluzione di MS del rilevamento del precursore/frammento di evitare sovrapposizioni MS segnali. La modalità di acquisizione ad alta selettività (HS) MRM descritta qui si avvale di entrambi questi approcci accoppiando la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide con l’alta risoluzione (Rs ~ 30.000) MS rilevamento di frammenti peptidici. Il test descritto qui copre almeno tre ordini di grandezza, che in genere è la gamma dinamica osservati in SRM/MRM proteomics esperimenti17,18,24.
Monitorando la linearità del segnale prodotto da sei standard del peptide a spillo alle concentrazioni differenti (intervallo 0,1 – 100 nM) in un digest di anticorpo monoclonale è stata dimostrata l’utilità del dosaggio HS-MRM per quantificazione di HCP.
Ad alta risoluzione (Rs > 20.000) spettrometria di massa è usata ordinariamente per la caratterizzazione strutturale di proteine terapeutiche su una varietà di piattaforme di strumento. Al contrario, quantificazione della proteina basate su MS viene in genere eseguita da SRM/MRM su a bassa risoluzione (Rs ~ 1.000) tandem quadrupolo spettrometri di massa utilizzando peptidi firma generate tramite la fenditura enzimatica di proteine11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. come singolo-dimensione separazioni cromatografiche non possono risolvere completamente miscele complesso peptide prodotte da digestione enzimatica, co-eluizione del peptide è un avvenimento comune, anche nel caso di un digest di singolo-proteina. Per raccolte del proteina molto complessi (ad es., per la quantificazione di 1-100 ppm di HCPs in presenza di un peptide ricco sfondo prodotta dalla proteina terapeutica), la sensibilità, precisione o linearità di SRM/MRM dosaggio può essere influenzata da interferenze.
I dosaggi SRM/MRM hanno selettività unidimensionale, basandosi solo su una combinazione di “unica” delle masse di precursore/frammento. Per questo motivo, queste analisi non riuscire in situazioni quando lo sfondo di peptide cambia in modo imprevisto (ad es., per la biofarmaceutica campioni ottenuti da procedure di purificazione diversi). Per superare queste limitazioni, vi proponiamo qui un saggio di ad alta selettività (HS) gestione record di messaggistica implementato su un ione abilitati alla mobilità ad alta risoluzione tempo di volo (QTOF) ibrido spettrometro di massa quadrupole (per il diagramma di strumento, vedi figura 6).
Lo strumento separa i precursori del peptide di interesse da altri precursori (interferenza) Co-eluizione di peptide nella cella di mobilità dello ione, consente di isolare la busta piena isotopica del precursore nel quadrupole e frammenti di esso con un fisso CE nella cella di collisione. Il segnale prodotto dal suo frammento del peptide più abbondante è ulteriormente rafforzato regolando la frequenza di pusher (Target Enhancement), che spinge in modo selettivo massa regioni di interesse nel tubo di volo, piuttosto che tutti gli ioni, come con una scansione completa. Quantificazione del peptide viene eseguita utilizzando i segnali di alta-MS-risoluzione (Rs ~ 30.000) prodotti da questo ione di frammento. Confronto con i dosaggi SRM/MRM, il dosaggio di HS-MRM offre due ulteriori livelli di selettività: uno è fornito tramite la separazione di mobilità dello ione precursore-livello, mentre il secondo è offerto dalla risoluzione di massa aumentata dell’analizzatore TOF. I risultati portati da questi miglioramenti di selettività sono visibili nei cromatogrammi di HS-MRM visualizzati nella figura 7, che sono privi di interferenze attraverso tre ordini di grandezza.
A differenza di analisi della SRM/MRM, ci sono diversi parametri che possono essere regolati per ottimizzare i dosaggi di HS-MRM: finestra RT intorno il precursore del peptide (in genere impostata a 0,2 min), la finestra di isolamento di quadrupolo (4 bis), la finestra di tempo di deriva che circonda il precursore (± FWHM del picco precursore dal corrispondente mobilogram di ioni) e la risoluzione di MS dello ione frammento (20.000-40.000). I dosaggi di HS-MRM sono molto sensibili: l’importo più basso rilevato per ogni peptidi PHO è 1 femtomole su colonna (o 0,1 nM in termini di concentrazione nel peptide). Quando si considera il peptide MW (Vedi tabella 1 per MWs accurata), l’importo rilevato in colonna è nell’ordine di 1-2 pg, mentre la colonna viene caricata con una quantità significativamente maggiore (2 µ g) di peptidi di sfondo dal digest di mAb.
Considerando il peso molecolare della proteina PHO Full-Length (97,2 kDa) da cui sono stati derivati i peptidi a spillo, il dosaggio è in grado di rilevare 50 ppm di un’impurità di proteine in presenza di ioni di alta-abbondanza sfondo. Limiti inferiori di rilevazione (5-10 ppm) sono realizzabili per peso molecolare inferiore HCPs (10-20 kDa). Il test comprende tre ordini di grandezza (come mostrato in curve di taratura da figura 8), che significa che può misurare HCPs nell’intervallo 1-1.000 ppm. Inoltre, la riproducibilità delle analisi HS-MRM, illustrato nella tabella 3, corrisponde molto bene con la riproducibilità delle analisi SRM/MRM della piccolo-molecola, con area di picco RSDs meglio 15%.
Abbiamo esplorato le funzionalità di un’analisi novella per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un digest di anticorpo monoclonale (mAb) e dimostrato la sua sensibilità e l’utilità per coprire la gamma dinamica ampia (almeno tre ordini di grandezza) in genere incontrate nell’analisi HCP. Tutti e sei gli standard del peptide sono stati rilevati alle concentrazioni basse quanto 0.1 nM (1 femtomole caricato su una colonna cromatografica di 2,1 mm ID) in presenza di uno sfondo di alta-abbondanza peptide (2 µ g di un digest caricato mAb in colonna). Incorporando sia mirata HRMS e separazione di precursore mobilità dello ione, il saggio di HS-MRM ha grande potenziale per diventare un saggio di monitoraggio veloce, ad alta produttività per più operatori sanitari attraverso più batch di biofarmaci.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrei ringraziare Lesley Malouin e Tony Catlin da Waters Corporation per la preparazione di figura 6 del manoscritto.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |