Summary

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Published: March 05, 2017
doi:

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

En la investigación médica, mucha atención se centra en proteínas de membrana, ya sea intrínsecos o extrínsecos, que participan en una variedad de interacciones de lípidos. Trabajando con proteínas lípidos interactuar incluye o bien la selección de un sustituto a los lípidos, tales como detergentes, amphipols 1, o proteínas pequeñas 2, o la búsqueda de un sustituto de la membrana que mantiene la proteína soluble y activa. Sustitutos de membrana lipoico incluyen liposomas y nanodiscos (ND) 3, 4.

Nanodiscos son plataformas de membrana cerca de nativos desarrollados por la ingeniería de la parte proteica, ApoA-1, de la lipoproteína de alta densidad (HDL) de origen natural en la sangre. ApoA-1 es una cadena de 243 residuos de longitud de cortos alfa-hélices anfipáticas y tiene una conformación soluble en lípidos libres. In vitro cuando en la presencia de lípidos, dos copias de la proteína ApoA-1 reordenan espontáneamente para rodear la hidrporción de la cadena de acilo ophobic de un parche bicapa lipídica 5. versiones de ingeniería de ApoA-1 generalmente se llaman proteínas de andamiaje de membrana (MSP), y un número creciente están disponibles comercialmente como plásmidos o como proteínas purificadas. Repeticiones o deleciones de los alfa-hélices de la ApoA-1 resultado en andamios proteínas de membrana 7 6 más largos o más cortos. Esto a su vez hace que sea posible formar discos de alrededor de 6 nm 7-17 nm 8 de diámetro. Hay diferentes tipos de aplicaciones para el nanodiscos 3, 9. La aplicación más utilizada es el de proporcionar un entorno de membrana casi nativo para la estabilización de una proteína de membrana 8, previamente revisados 3, 9. Un uso menos explorada-es proporcionar una superficie de membrana nanoescala para el estudio demembrana periférica proteínas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Sección 1 del protocolo a continuación visualiza el procedimiento para hacer nanodiscos compuestas de fosfolípidos y proteínas de andamiaje membrana.

Preparación de la muestra es un cuello de botella en la mayoría de los métodos. muestras específicas del método pueden añadir información en particular, pero también hacer comparaciones de los resultados difícil. Por lo tanto, es más simple cuando las muestras son multimodal y se pueden utilizar directamente en varios métodos diferentes. Una de las ventajas con el uso de nanodiscos es el pequeño tamaño de la nanodisc en comparación con liposomas (por ejemplo, las muestras se pueden utilizar directamente para ambos TEM y electroforesis en gel no desnaturalizante, como en el presente Protocolo).

<p class = "jove_content"> Las vesículas y liposomas han sido utilizados para comprender la función de la membrana de proteínas que interactúan. Para los estudios estructurales y de visualización, un ejemplo de la determinación estructural de una proteína transmembrana en liposomas está disponible 18. Sin embargo, ninguna estructura 3D de alta resolución de una proteína de membrana monotópico incrustado en una membrana del liposoma se ha publicado todavía, en lo que sabemos. Nanopartículas o anticuerpos oro puede ser utilizado para visualizar las proteínas de unión a liposomas o vesículas utilizando TEM 19. A pesar de que estas sondas son muy específicos, que podrían interferir con las proteínas de unión a la membrana por el velo del sitio de unión de membrana o por áreas de interés con las partes flexibles de enmascaramiento. Marcado con oro o proteínas de anticuerpo complejado probablemente podría ser analizado en un gel, pero esto aumentaría el costo del experimento.

Aunque los liposomas son una excelente plataforma, no se puede estar seguro de que el populación tiene una relación particular de proteína por liposoma, una característica que puede ser explorado por el uso de nanodiscos 20. En un liposoma, cofactores y sustratos pueden ser atrapados en el interior soluble. Las sustancias que son solubles en la membrana compartirán el mismo destino para ambos tipos de miméticos de membrana. Sin embargo, como la zona de dos capas es más pequeño en nanodiscos, se requiere una menor cantidad de sustancia para saturar las membranas nanodisc.

función de las proteínas comprensión a través de la determinación de la estructura atómica ha sido esencial para muchos campos de investigación. Los métodos para la determinación de la estructura de proteínas incluyen rayos-X 21; resonancia magnética nuclear (NMR) 22, 23; y microscopía electrónica de transmisión (TEM) 24 a temperaturas criogénicas, cryoEM. La resolución por cryoEM últimamente se ha mejorado en gran medida, debido principalmente a la utilización de electrones de directadetectores 25, 26. Las macromoléculas son imágenes en, hielo vítreo delgada 27 en un estado casi nativo. Sin embargo, debido al bajo contraste de las moléculas biológicas, se convierten en difíciles de detectar en el rango de tamaño de 100 a 200 kDa. Para muestras de tamaño adecuado, la recogida de datos se puede realizar y el método de reconstrucción de partícula única se puede aplicar para obtener una estructura 28.

Sin embargo, la determinación de la estructura de la proteína por TEM es un proceso de múltiples pasos. Por lo general comienza con la evaluación de monodispersividad muestra mediante tinción negativa TEM 29 utilizando sales de metales pesados como el phosphotungsten (PT) 30 31 o uranio. La reconstrucción de un modelo de baja resolución de la macromolécula con tinción negativa se hace generalmente y puede proporcionar información importante sobre la estructura molecular 29. En paralelo,Recopilación de datos mediante cryoEM puede comenzar. Se debe tener cuidado al evaluar los datos de TEM de tinción negativa para evitar la mala interpretación de formación de artefactos. Un artefacto en particular es el efecto de la mancha PT en fosfolípidos y liposomas 32, lo que resulta en la formación de varillas largas se asemejan a las pilas de monedas, vista desde el lado 33. Tal "cartucho de dinero" o "pilas" (de aquí en adelante designado como "pilas") se observaron desde el principio para el HDL de 34 años, y más tarde también para nanodiscos 35.

El apilamiento y la reorganización de las membranas pueden ocurrir por muchas razones. Por ejemplo, puede ser inducida por co-factores como el cobre, que se muestran por imágenes TEM en una mancha de molibdato de amonio 36. Una fracción de los lípidos de membrana en liposomas contenía un grupo de cabeza de ácido iminodiacético imitando la formación de complejos de metal por EDTA, apilando de este modo los liposomas después de la adición de iones de cobre <shasta class = "xref"> 36. Stacking también podría ser debido a una interacción proteína-proteína por una proteína en o sobre las bicapas lipídicas (la mancha utilizado no se menciona) 37. Se observó temprano en la formación de pila de fosfolípidos por PT; Sin embargo, el trabajo posterior se ha centrado en la eliminación o supresión de esta formación artefacto 38.

En este caso, se propone un método para tomar ventaja de la nanodisc inducida por NAPT apilamiento para el estudio de las proteínas de unión a la membrana por TEM. En resumen, la unión de las proteínas nanodiscos impediría que los nanodiscos de apilamiento. Aunque las razones para el apilamiento no son claros, se propuso 39 que hay una interacción electrostática entre los fosfolípidos y el grupo fosforilo de PT, haciendo que los discos a pegarse entre sí (Figura 1A). La hipótesis detrás de nuestro protocolo es que cuando una proteína se une a una nanodisc, la mayor parte de la superficie de fosfolípido no es availa ble para la interacción con el PT debido a impedimento estérico por la proteína. Esto evitaría la formación de la pila (Figura 1B). Dos conclusiones pueden extraerse. En primer lugar, la prevención de apilamiento significa que la proteína de interés se ha unido a la membrana. En segundo lugar, el complejo proteína-ND se puede tratar con los métodos de procesamiento de una sola partícula estándar 24, 40 para obtener una morfología rugosa del complejo. Por otra parte, los análisis mediante métodos como la electroforesis en gel no desnaturalizante o dispersión de luz dinámica se puede realizar.

Para demostrar esta hipótesis, se utilizó la proteína de unión a membrana de 5-lipoxigenasa (5LO), que está implicado en muchas enfermedades inflamatorias 41, 42. Esta proteína de 78 kDa requiere iones de calcio para unirse a su membrana 43. Aunque esta asociación a la membrana se ha estudiado ampliamente el uso de liposomass = "xref"> 44, 45, 46 y las fracciones de membrana 47, éstas no se pueden utilizar para el análisis de TEM y determinación de la estructura.

La preparación de nanodiscos comienza mezclando MSP con lípidos se resuspendieron en el colato de sodio detergente. Después de la incubación en hielo durante 1 h, el detergente se retira lentamente de la mezcla de la reconstitución utilizando una resina adsorbente. Este tipo de material se hizo con frecuencia de forma en pequeñas perlas de poliestireno. Son relativamente hidrófobo y tienen una fuerte preferencia por la unión de detergente en comparación con los lípidos 48. Después de retirar las perlas hidrófobas y la realización de la clarificación mediante centrifugación, las nanodiscos se purifican por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Los nanodiscos purificados se mezclaron con una proteína de membrana monotópico (y posibles cofactores) en una relación equimolar (o varias relaciones de valoración) y se dejan a react (15 min). El análisis por TEM se lleva a cabo mediante la aplicación de mu L-cantidades de muestra sobre, rejillas revestidas de carbono resplandor descargada y luego mediante la realización de tinción negativa con NAPT. La misma muestra de cuando las alícuotas se aplicaron a las rejillas TEM se puede utilizar para el análisis por no desnaturalizante o PAGE SDS-electroforesis en gel, así como por varios tipos de mediciones de la actividad, sin cambios importantes.

Protocol

1. Preparación de nanodiscos Expresión y purificación de la proteína de andamiaje de la membrana 8, 35 Expresar el MSP1E3D1 marcada con His en el E. coli BL21 (DE3) cepa T1R pRARE2 en frascos. Preparar un cultivo iniciador durante la noche de 50 ml con medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina a 37 ° C. Diluir el cultivo iniciador durante la noche en 2 L de medio de caldo excelente suplementado con 50 g / ml de kanamicin…

Representative Results

El método que proponemos depende de la preparación de nanodiscos para proporcionar la superficie de la membrana para la unión monotópico membrana-proteína. Como no existe una proteína transmembrana incrustado en la bicapa lipídica nanodisc, los nanodiscos están aquí denotan como "nanodiscos vacías" (Figura 2A). Estos tienen un peso molecular calculado de 256 kDa para una composición de dos proteínas MSP1E3D1 andamios y alrededor de 260 moléculas de…

Discussion

El método se puede separar en tres partes: la reconstitución de nanodiscos vacíos, la preparación de complejos de proteína-nanodisc, y de la tinción negativa para el TEM de estos complejos. Cada parte se trata de forma independiente con respecto a las limitaciones de la técnica, los pasos críticos, y las modificaciones útiles.

La reconstitución de nanodiscos vacías. Los pasos críticos y limitaciones en la producción y uso de nanodiscos.

Para la preparac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen el Consejo Sueco de Investigación, Consejo del Condado de Estocolmo, y los fondos de KI por su apoyo. La expresión y purificación de MSP se llevó a cabo en el Instituto Karolinska de proteína / SciLifeLab Fondo para la Ciencia Core (http://PSF.ki.se). Los autores también desean agradecer al Dr. Pasi Purhonen Mathilda y el Dr. Sjöberg por compartir sus conocimientos técnicos y su ayuda oportuna.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., Duzgunes, N. e. j. a. t., et al. . Methods in Enzymology. 464, 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination – the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. 生物化学. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. 生物化学. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Play Video

Cite This Article
B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

View Video