Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols ¹ o piccole proteine ^2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteica, ApoA-1, della lipoproteina ad alta densità (HDL) naturalmente nel sangue. ApoA-1 è un residuo di 243-lunga catena di brevi anfipatiche alfa-eliche e presenta una conformazione solubile privo di lipidi. In vitro quando in presenza di lipidi, due copie della proteina ApoA-1 spontaneamente riorganizzano per circondare il hydrophobic porzione catena acilica di un doppio strato lipidico cerotto ^5. versioni Engineered di ApoA-1 sono generalmente chiamati ponteggi proteine ​​di membrana (MSP), e un numero crescente sono disponibili in commercio come plasmidi o proteine ​​purificate. Ripetizioni o cancellazioni delle alfa-eliche in ApoA-1 risultato in più ⁶ o più brevi ponteggi proteine di membrana ^7. Questo a sua volta rende possibile l'ottenimento di dischi circa 6 nm ⁷ a 17 nm ⁸ di diametro. Ci sono diversi tipi di applicazioni per il nanodiscs ^{3, 9.} L'applicazione più comunemente usato è quello di fornire un ambiente membrana quasi nativa per la stabilizzazione di una proteina integrale di membrana ^8, recensito in precedenza ^{3, 9.} Un uso meno esplorato è quello di realizzare una superficie di membrana nanoscala per lo studioperiferica di membrana proteine ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Sezione 1 del protocollo di sotto visualizza la procedura relativa alle nanodiscs composte da fosfolipidi e proteine ​​di membrana impalcature.

La preparazione del campione è un collo di bottiglia nella maggior parte dei metodi. campioni specifici del metodo può aggiungere informazioni particolari, ma anche fare i confronti dei risultati difficili. Pertanto, è più semplice quando i campioni sono multimodale e possono essere utilizzati direttamente in diversi metodi. Un vantaggio con l'uso di nanodiscs è la piccola dimensione del nanodisc rispetto ai liposomi (ad esempio, i campioni possono essere utilizzati direttamente per entrambi TEM e non denaturante gel elettroforesi, come nel presente protocollo).

<p class = "jove_content"> vescicole e liposomi sono da tempo utilizzati per comprendere la funzione delle proteine ​​di membrana interagenti. Per gli studi strutturali e visualizzazione, un esempio della determinazione strutturale di una proteina transmembrana in liposomi è disponibile ^18. Tuttavia, nessuna struttura 3D ad alta risoluzione di una proteina di membrana monotopic incorporato in una membrana liposomiale è stato ancora pubblicata, per quanto ne sappiamo. Nanoparticelle d'oro o anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare proteine leganti di liposomi o vescicole usando TEM ^19. Anche se queste sonde sono molto specifici, potrebbero interferire con proteine ​​di membrana vincolante velando il sito di legame della membrana o mascherando le aree di interesse con le parti flessibili. Gold-etichettato o proteine ​​anticorpi complessato potrebbe probabilmente essere analizzati su un gel, ma ciò aumenterebbe il costo dell'esperimento.

Anche se liposomi sono un'eccellente piattaforma, non si può essere certi che il poplamento ha un rapporto particolare di proteine per liposoma, una caratteristica che può essere esplorato con l'uso di nanodiscs ^20. In un liposoma, cofattori e substrati possono essere intrappolati all'interno solubile. Le sostanze che sono membrana-solubili condivideranno lo stesso destino per entrambi i tipi di mimetici di membrana. Tuttavia, come la zona doppio strato è più piccola in nanodiscs, una minore quantità di sostanza è necessaria per saturare le membrane nanodisc.

proteina funzione intesa attraverso la determinazione della struttura atomica è essenziale per molti campi di ricerca. Metodi per la determinazione della struttura proteica comprendono raggi X ^21; risonanza magnetica nucleare (NMR) ^{22, 23;} e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ²⁴ a temperature criogeniche, cryoEM. La risoluzione cryoEM ultimamente è stata notevolmente migliorata, principalmente per l'uso di elettroni de direttatectors ^{25, 26.} Le macromolecole vengono esposte in un sottile, ghiaccio vitreo ²⁷ in uno stato quasi native. Tuttavia, a causa del basso contrasto di molecole biologiche, diventano difficili da individuare nella gamma di dimensioni 100 – 200 kDa. Per i campioni di dimensioni opportune, raccolta dei dati può essere fatta e il metodo di ricostruzione singola particella può essere applicato per ottenere una struttura ^28.

Tuttavia, la determinazione della struttura delle proteine ​​mediante TEM è un processo a più fasi. Di solito inizia con la valutazione di monodispersity campione negativo-macchia TEM ²⁹ con sali di metalli pesanti come phosphotungsten (PT) ^{30 31} o uranio. Ricostruzione di un modello a bassa risoluzione della macromolecola macchiato negativamente è di solito fatta e può fornire informazioni importanti sulla struttura molecolare ^29. In parallelo,la raccolta dei dati utilizzando cryoEM può iniziare. Si deve prestare attenzione quando si valutano i dati TEM negativo-macchia per evitare l'errata interpretazione di formazione manufatto. Un particolare manufatto è l'effetto della macchia PT su fosfolipidi e liposomi ^32, con conseguente formazione di lunghe aste somiglianti pile di monete viste dal lato ^33. Tale "rouleau" o "stack" (di seguito indicato come "stack") sono stati osservati nella fase iniziale per HDL ^34, e più tardi anche per nanodiscs ^35.

L'accatastamento e rimodellamento delle membrane possono verificarsi per molte ragioni. Ad esempio, può essere indotta da cofattori come il rame, mostrate da immagini TEM in ammonio molibdato macchia ^36. Una frazione dei lipidi di membrana in liposomi conteneva un gruppo di testa di acido iminodiacetico imitando metallo complessazione da EDTA, impilamento così liposomi dopo l'aggiunta di ioni rame <sfino class = "xref"> 36. Stacking potrebbe anche essere dovuto ad una interazione proteina-proteina mediante una proteina nei o sui doppi strati lipidici (la macchia utilizzato non è menzionato) ^37. La formazione pila di fosfolipidi da PT è stato osservato nella fase iniziale; Tuttavia, il lavoro in seguito si è concentrata sulla rimozione o abolire questa formazione artefatto ^38.

Qui, vi proponiamo un metodo per sfruttare la nanodisc NAPT indotto accatastamento per lo studio delle proteine ​​di membrana-binding da TEM. In breve, vincolante per le proteine ​​nanodiscs impedirebbe i nanodiscs da accatastamento. Sebbene le ragioni per l'impilamento non sono chiari, è stato proposto ³⁹ che vi è una interazione elettrostatica tra i fosfolipidi e il gruppo fosforile di PT, causando i dischi di aderire l'uno all'altro (Figura 1A). L'ipotesi dietro il nostro protocollo è che quando una proteina si lega ad un nanodisc, la maggior parte della superficie fosfolipide non è dispo BLE per l'interazione con il terminale a causa dell'impedimento sterico dalla proteina. Ciò impedisce la formazione di stack (Figura 1B). Due conclusioni possono essere tratte. In primo luogo, la prevenzione di impilamento significa che la proteina di interesse è legato alla membrana. In secondo luogo, il complesso proteina-ND può essere trattato con metodi di lavorazione singola particella standard di ^{24, 40} per ottenere una morfologia ruvida del complesso. Inoltre, le analisi con metodi come non-denaturazione elettroforesi su gel o dispersione della luce dinamica può essere eseguita.

Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la proteina di membrana-binding 5-lipossigenasi (5LO), che è coinvolto in molte malattie infiammatorie ^{41, 42.} Questa proteina 78-kDa richiede ioni di calcio di legarsi alla sua membrana ^43. Anche se questa associazione membrana è stata ampiamente studiata utilizzando liposomis = "xref"> ^{44, 45, 46} e frazioni di membrana ^47, questi non possono essere utilizzati per l'analisi TEM e determinazione della struttura.

La preparazione di nanodiscs inizia MSP con lipidi risospese nel colato di sodio detergente miscelazione. Dopo incubazione in ghiaccio per 1 h, il detersivo viene lentamente rimosso dalla miscela ricostituzione con una resina adsorbente. Questo tipo di materiale è spesso realizzato in polistirene forma in piccole perline. Essi sono relativamente idrofobo e hanno una forte preferenza per il detersivo vincolante rispetto ai lipidi ^48. Dopo aver rimosso le perline idrofobiche e l'esecuzione di un chiarimento mediante centrifugazione, i nanodiscs sono purificati mediante cromatografia dimensione esclusione (SEC). I nanodiscs purificati vengono miscelati con una proteina di membrana monotopic (ed eventuali cofattori) in rapporto equimolare (o più rapporti per una titolazione) e sono lasciate rEACT (15 min). Analisi mediante TEM viene effettuata applicando microlitri-quantità di campione attraverso, griglie di carbonio rivestiti bagliore scarica e poi effettuando colorazione negativa con NAPT. Lo stesso campione da cui le aliquote sono state applicate alle griglie TEM può essere utilizzato per l'analisi non-denaturazione o SDS PAGE gel elettroforesi, nonché da vari tipi di misure di attività, con grandi cambiamenti.