This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Eine der wichtigsten Fragen für das Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie einzelne Zellen während der Organ Differenzierung und das Wachstum verhalten. Idealerweise können zelluläre Ereignisse, wie Genexpressionsmustern und intrazelluläre Proteinlokalisation, in dem Licht einer größeren Kontext des Gewebes gesehen werden. Dieses Ziel stellt technische Herausforderungen und erfordert ganze Organ Beobachtung mit einer hohen räumlichen sowie zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, die phototoxische Effekte verursachen können. Da Pflanzen auf Umweltveränderungen schnell anzupassen, sind die Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Um mit dem physiologischen Zustand der Anlage ohne störende Langzeit-Bildgebung zu tun, müssen drei Dinge sichergestellt, 1) Wachstumsbedingungen in der Probenkammer sein, 2) stabile Probe über lange Zeiträume Montage und 3) die Abbildungs mit geringen Lichtintensitäten Foto-Schäden und nicht-physiologischen Bedingungen zu vermeiden.
Physiologische wachsenden conditions in der Kammer Mikroskop Probe sind von entscheidender Bedeutung für die langfristige Experimente. Es gibt eine Reihe von Protokollen zur Verfügung , die Abbildungswachstumskammern für konfokale Mikroskope 1 beschreiben – 3. Jedoch führt der konfokalen Mikroskopie eine hohe Lichtintensität auf die Anlage, die 4 Antworten Stress und in der Regel hemmt das Wachstum führen kann. Darüber hinaus erlauben die meisten herkömmlichen Mikroskopen nur horizontale Positionierung der Probe, die für die Pflanzen nicht optimal ist, da sie versuchen, sich neu zu orientieren und zu dem Vektor der Schwerkraft wachsen. In den letzten zehn Jahren hat sich Lichtbogen – Mikroskopie als ein mächtiges Werkzeug entstand die Entwicklung von großen Proben bei zellulärer Auflösung für Zeiträume von bis zu mehreren Tagen 5 zu erfassen – 9. Lichtbogen – Mikroskopie ermöglicht es, die Probe vertikal positioniert und wird zunehmend in der Pflanzenforschung verwendet Wurzelentwicklung studieren 10-21, kürzlich rezensiert von Berthet und Maizel 22. Viele der genannten Studien 10,13 – 18,21 wurden im Labor von Ernst HK Stelzer optimiert und führten eine besondere Art der Probe unter Verwendung Halterung 17 durch Züchten der Wurzel auf der Oberfläche eines Gels gekennzeichnet. In diesen Studien wurde eine maßgefertigte Mikroskop verwendet wird, in dem die Pflanze aus dem Boden gehalten wird. Im Gegensatz dazu halten die Mehrheit der breit verfügbaren Lichtbogen Mikroskope die Probe von der Spitze. Somit ist diese besondere Herstellungsverfahren nicht ohne weiteres angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode liefert ein Protokoll für die gut etablierte auf Oberflächenmontageverfahren anwendbar für die OpenSPIM 23, einem Open – Access – Plattform für die Anwendung und Verbesserung der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM).
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es langfristige Bildgebung von Arabidopsis Wurzeln in der OpenSPIM Lichtbogen Mikroskop zu ermöglichen. Dies wird durch das Züchten einer Pflanze aufrecht auf den s erreichturface eines Gels mit den Wurzeln in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze, eine maßgeschneiderte Beleuchtungssystem , um sicherzustellen , beleuchtet die Blätter , aber nicht die Wurzeln (Abbildung 1).
Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie hat den großen Vorteil niedrige Phototoxizität und ultraschnelle Aufnahmegeschwindigkeit zu kombinieren, die verwendet werden können, ein großes Volumen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen, während die Probe in einem physiologischen Zustand zu halten. Die Auflösung eines Lichtblatt – Mikroskop kann mit dem von einem konfokalen Mikroskop 9 verglichen werden. Jedoch tritt Lichtstreuung und Absorption entlang der Anregungs- und Emissionspfad individuell und die Gesamtbildqualität kann innerhalb opaken Gewebe im Vergleich zu der Oberfläche deutlich geringer sein. Um diese Komplikation zu umgehen kann man die Möglichkeit verwenden, um die Probe entlang der vertikalen Achse zu drehen, und das gleiche Volumen aus verschiedenen Richtungen beobachten. Aber dies ist nicht immer von Vorteil, zB Seitenwurzeln entstehen auf der einen Seite der Wurzel und Bildgebung von hinten führt zu einer niedrigen Bildqualität ohne weitere Informationen zu gewinnen. Jedoch kann die Drehung hauptsächlich die samp Positionierung verwendet werden,le in der besten Weise. Die klassische horizontale Anordnung der Objektive ermöglicht neue Wege der Probenmontage. Pflanzen profitieren von einer vertikalen Position. Hier vorgestellte, die "auf der Oberfläche des Gels" Montageverfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Befestigungsarten , wie beispielsweise die Wurzel innerhalb eines Gels 24,25 einzubetten. 1) Das Wurzelsystem ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium. Die Probenkammer ist mit einem Perfusionssystem verbunden, die kontinuierlich frisches Medium zur Verfügung stellt. Es kann auch schnell verwendet werden, um das gesamte Volumen der Probenkammer auszutauschen, um verschiedene Medien oder Medikamente anwenden. 2) Vor der Probenvorbereitung Pflanzen wachsen, wie sie in Laboratorien verwendet werden, um zu wachsen. Die Pflanzen können müssen die gewünschten Pflanzen vorbereitet werden unter einem Fluoreszenzmikroskop und nur dann ausgewählt werden. 3) Die Anlage ist aus der Petrischale an den Probenhalter übertragen, ohne berührt zu werden. Dadurch kann die Anlage weiter zu entwickeln auf dem gleichen Gel wurde in der Wachstums incubato wachsen aufr und mechanische Beanspruchung auf ein Minimum reduziert. 4) Die Ansicht auf der Probe ist frei und optische Aberrationen minimiert werden, da der Raum zwischen der Probe und dem Erfassungsziel nur mit Medium und keine anderen Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gefüllt ist.
Um eine langfristige Bildgebung, die Anlage Beleuchtungssystem zur Durchführung notwendig photosynthetische Aktivität der Anlage zu gewährleisten. In den meisten Laboratorien Pflanzen wachsen auf einem transparenten Gel, dh die Wurzeln Licht ausgesetzt werden. Dies kann unterschiedliche Reaktionen auf ihre Umwelt verursachen und induziert Veränderungen in ihrer Biochemie und Entwicklung 26,27. Um zu reduzieren, wurde die Menge des Lichts auf das Wurzelsystem, schwarze Plastikfolie verwendet, um die Wasseroberfläche sowie einen Deckel aus schwarzem Aluminiumfolie zu bedecken bedeckt die Probenkammer. Licht kann die Anlage verlässt durch das zentrale Loch im Deckel erreichen. In dieser Konfiguration wurde kein Anstieg der Hintergrundlicht beobachtet, suggesting, die die Menge an Streulicht von den roten und blauen LEDs wesentlich durch die GFP-Filter und die Abschattung Ansätze reduziert wurde. Dies erlaubt das Licht während der Bildaufnahme gedreht zu halten, ohne die Kamera Hintergrundrauschen zu erhöhen.
Der Probenhalter ist für den 3D-Druck entwickelt. Jedoch ist die Auswahl des Materials wichtig, da einige Kunststoffe, die nicht zu 100% stabil getestet wurden, waren, in einer Drift der Probe resultiert. Daher wird empfohlen, Harze stattdessen zu verwenden oder den Probenhalter aufzubauen, indem ein Polyethylen (PEP) Stange Fräsen. Wenn ein Lichtbogen Mikroskopaufbau mit einem doppelseitigen Beleuchtungssystem unter Verwendung der Halter Probe könnte mit einer der Licht Blätter stören auf dem Drehwinkel abhängig. während Schöpfen die Pflanze von der Platte, mit einem flachen Winkel der Spachtel, um mechanische Belastung zu reduzieren. Die Anlage kann schnell austrocknen und Erfahrung Luftstrom zum ersten Mal. Versuchen Sie, jede Zugluft zu vermeiden (schnelle Bewegungen, Klimaanlage Fluss), work ohne Unterbrechung und schieben Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Im Inneren des Mikroskops ist es entscheidend, die ganze Pflanze in Flüssigkeit nicht tauchen und die Blätter trocken halten.
Die Technik ist ideal für frühe Stadien der Seitenwurzelbildung Bildgebung. Wenn langfristige Darstellung von reifen Wurzelspitzen durchführt, muss man bedenken, dass Arabidopsis Wurzeln mit 100-300 & mgr; m / h wachsen schnell aus dem Blickfeld. Eine sehr nützliche zukünftige Implementierung könnte ein automatisiertes Tracking-Algorithmus sein, der folgende Wurzelspitze Wachstum über längere Zeiträume ermöglichen würde. Die Fähigkeit, Umgebungsbedingungen zu steuern, wie Licht und Nährstoffzusammensetzung des Mediums während des Akquisitionsprozesses ermöglicht es zu untersuchen, wie Pflanzen an Veränderungen anpassen. Die Wurzel ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, die verwendet werden können Medikamente anwenden , um chemisch – Genexpression, beispielsweise unter Verwendung des Dexamethason induzierbar 28 oder die β-estr aktivierenAdiol induzierbares System 29. Allerdings dauert es Zeit, um das gesamte Volumen der Probenkammer zum Austausch eines Arzneimittels auszuwaschen. Das Setup kann durch Minimieren des Volumens der Probenkammer verbessert werden Mediumaustausch zu beschleunigen. Dennoch hat diese Technik ein großes Potenzial. Die Kombination von Montageverfahren, standardisierte Anbaubedingungen und die sanfte Bildaufnahme mit Hilfe von Licht-Blatt-Mikroskopie ermöglicht Langzeitstudien der Pflanzenentwicklung mit hoher Auflösung auf physiologischer Ebene. Dies wird den Forschern helfen, grundlegende Mechanismen der pflanzlichen Entwicklung zu erforschen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Matyáš Fendrych für das kritische Lesen / Betrachten und Stephan Stadlbauer für die Audiogeräte. Dank der Miba Machine Shop bei IST Österreich für ihren Beitrag zur OpenSPIM. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben Mittel aus dem Programm Menschen (Marie-Curie-Maßnahmen) der Europäischen Union des Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter REA Finanzhilfevereinbarung Nr [291734] und European Research Council (ERC-Projekt-2011 erhalten -StG-20101109-PSDP).
Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |