植物根系的轻质板材荧光显微镜生长在一个凝胶表面
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
其中一个在认识植物生长发育的关键问题是单个细胞器官分化和生长过程中的行为方式。理想情况下，细胞的活动，如基因表达模式和细胞内蛋白质的定位，可以在组织更大范围的光线中。这个目标带来的技术挑战，需要具有高的空间整个器官的观察以及在一段延长的时期，这可能会导致光毒性作用的时间分辨率。由于植物快速适应环境的变化，不断增长的条件必须严格控制。为了做到长期成像，而不与植物的生理状态的干扰，三件事情都必须确保，1）生长条件在样品室中，2）稳定样品放置过长时间，以及3）的摄像低的光强度，以避免光损伤和非生理条件。
生理成长conditi组件在显微镜试样腔室是用于长期实验的关键。有一些描述成像生长室的共焦显微镜1可用的协议– 3。然而，共焦显微镜引入高的光强度的植物，这可能会导致应激反应，通常抑制4的生长。此外，大多数常规显微镜使样品，因为他们试图重新定位自己和生长朝向重力的载体，其是不是最佳的植物仅水平定位。在过去的十年里，光片显微镜已成为一个强大的工具，捕捉到较大的标本在细胞分辨率发展的时间段数天5 – 9。光表镜允许垂直放置标本和植物的研究越来越多地用于研究根系发育10 – 21，最近由伯特审查T和Maizel 22。许多提到的研究10,13的– 18,21进行了优化，并在恩斯特HK施特尔策的使用样本的一种特殊的方式在实验室进行的安装件，其特征通过凝胶17的表面上生长的根。在这些研究中，使用定制的显微镜，其中所述植物是从底部保持。与此相反，大多数广泛提供光片的显微镜保持从顶部样品。因此，这个特定的制备方法不能容易地应用。这里介绍的方法提供了适用于OpenSPIM 23，用于施加和提高选择性平面照明显微镜（SPIM）开放式接入平台行之有效的上表面安装方法的协议。
此协议的总体目标是使拟南芥根系长期成像在OpenSPIM光表镜。这是通过在S直立生长的植物来实现在液体介质中的根的凝胶urface而叶子留在空气中。为了确保植物的光合活性，定制的照明系统照射的叶子，但不根（ 图1）。
Protocol
Representative Results
Discussion
光表荧光显微镜具有很大的优势，以低光毒性和超快采集速度，其可以被用来捕捉大量具有高时空分辨率的同时保持样品中的生理状态相结合。光片显微镜的分辨率可以相比，共聚焦显微镜9。然而，光散射和吸收沿激发和发射路径中发生单独和总体图像质量可以是不透明的组织内显著相比降低到表面。为了避免这种复杂人们可以使用的可能性来旋转沿垂直轴的样品和观察从不同的方向相同的体积。但是，这并不总是有利的， 例如侧根根和成像从后面在低图像质量的结果的一侧出现没有获得更多的信息。然而，旋转可以被主要用于定位SAMP乐以最好的方式。物镜的经典横向布置允许样品安装的新方法。植物受益于垂直位置。相比于其它的安装方法，例如嵌入凝胶24,25的内侧的根这里提出，该安装方法“的凝胶的表面上的”具有几个优点。 1）根系统是在与液体介质直接接触。样品室被连接到灌注系统，该系统提供了连续的新鲜培养基。它也可以用于快速交换样品室的整个体积应用不同的介质或药物。 2）之前，样品制备植物生长，因为它们是用来在实验室中生长。植物可以在荧光显微镜下被选择和仅所需的植物需要准备。 3）植物从培养皿到样品保持器，而不被触摸传送。从而植物可以进一步在其上在生长incubato生长在相同的凝胶开发r和机械应力减小到最低限度。 4）在试样上的视图是通畅和光学像差最小化，因为在样品和检测目标之间的空间完全填充有培养基并用不同折射率没有其它材料。
为了进行长期成像，植物照明系统是必要的，以确保植物的光合活性。在大多数实验室植物生长上的透明凝胶， 即根暴露于光。这可能会导致他们的环境不同的反应，诱导其生物化学和发展变化26,27。为了减少根系统上的光的量，黑色的塑料箔被用于覆盖水面以及由黑色铝箔的盖所覆盖的样品室中。光可到达植物的叶通过在盖的中心孔。在这种设置中，在背景灯没有增加观察，suggestin克杂散光从红色和蓝色发光二极管的量显著由GFP过滤器和遮光的方法降低。这使得保持图像采集过程中开了灯不增加相机的背景噪声。
样品架被设计用于三维印刷。但是，材料的选择是关键，因为被测试的几个塑料均不是100％的稳定，从而导致样品的漂移。因此，建议改用树脂或通过研磨一个聚乙烯（PEP）杆构建样品架。当使用光片显微镜设置用双面照明系统的样品夹持器可能会根据旋转角度的光片材之一干扰。从板块舀植物中减少机械应力，用锅铲的平角。该工厂能迅速干透，为第一次体验气流。尽量避免任何空气草案（快速移动，空调流量），WORK尽可能样品架，并不间断地滑向1000微升枪头。显微镜内，这是至关重要的不浸在液体中的全厂和保持叶片干燥。
该技术是理想的成像侧根形成的早期阶段。当执行成熟的根尖长期成像我们必须牢记，拟南芥根与100-300微米/小时迅速增加出来的视场。一个非常有用的今后的实施可能是一个自动跟踪算法，这将使以下根尖生长在延长的时间段。在采集过程控制环境条件，例如光与介质的营养组合物中的能力允许调查植物如何适应变化。根是在与液体介质，其可以用于应用药物化学激活基因表达的直接接触，例如使用地塞米松诱导的28或β型雌adiol诱导系统29。然而，需要时间来交换样品室的整个体积洗出的药物。设置可以通过减少样品室的体积以加速介质交换来改善。然而，该技术具有很大的潜力。安装过程中，标准化的生长条件，并使用光表镜温柔的图像采集相结合，使植物的生长发育具有高分辨率的长期研究在生理水平。这将有助于研究人员能够探索植物发育的基本机制。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢马加什Fendrych为批判性阅读/查看和斯蒂芬Stadlbauer的音频设备。感谢米巴机械车间在IST奥地利为他们的OpenSPIM贡献。导致这些结果的研究已根据REA赠款协议N°[291734]和欧洲研究委员会（ERC项目2011年获得了资金从人计划（玛丽·居里行动）欧盟第七框架计划（FP7 / 2007-2013）的-StG-20101109-PSDP）。
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
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