Summary

Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour la collecte de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) de moyenne Climatisé (MESC-CM) dérivé de sérum (sérum fœtal bovin, FBS) – et d'alimentation (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) conditions sans gluten pour une cellule approche -free. Il peut être applicable pour le traitement du vieillissement et de maladies associées au vieillissement.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

L'objectif de ce protocole est de recueillir des souris embryonnaires cellules souches (MESC) moyenne Climatisé (MESC-CM) à partir des conditions de culture sans sérum et sans alimentation et de caractériser ses fonctions biologiques.

En général, les cellules souches embryonnaires (CSE) ont un grand potentiel pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire en raison de leur pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement 1-3. Cependant, la transplantation directe de cellules souches a plusieurs limitations, telles que le rejet immunitaire et la formation de tumeurs 4,5. Par conséquent, une approche sans cellule peut fournir une stratégie thérapeutique alternative pour la médecine régénérative et les interventions de vieillissement 6,7.

La sénescence est considérée comme une contrepartie cellulaire au vieillissement des tissus et des organes, caractérisé par un état permanent d'arrêt de la croissance, la physiologie cellulaire altérée, et les comportements. Le vieillissement est le principal facteur de risque pour les maladies courantes, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires, type 2 diabète, et la neurodégénérescence 8. Une des caractéristiques évidentes du vieillissement est la baisse du potentiel de régénération des tissus, qui est causée par le vieillissement de cellules souches et de l' épuisement 9. De nombreuses études ont montré d' importantes molécules pharmacologiques, tels que la rapamycine 9, le resvératrol 10, et de la metformine 11, et les facteurs systémiques sang, à savoir GDF11 12, qui ont la capacité de retarder constamment le vieillissement et de prolonger la durée de vie.

Dans la présente étude, MESC-CM a été récolté sans sérum (sérum fœtal bovin, FBS) et alimentation (fibroblastes de souris embryonnaires, MEF) couches d'exclure la contamination des facteurs sériques et les facteurs sécrétoires de MEF. Ces conditions ont permis une CM et sans sérum d'alimentation qui a permis par conséquent l'identification précise des facteurs sécrétoires MESC spécifiques.

Ce protocole proposé est très efficace, relativement rentable et facileopérer. Cette technique donne un aperçu de la caractérisation des facteurs solubles MESC dérivés qui peuvent arbitrer un effet anti-sénescence, qui peut être utilisé pour le développement d'une approche thérapeutique acellulaire sûre et potentiellement avantageuse vers les interventions pour les maladies liées au vieillissement associées et autres régénérative traitements.

Protocol

REMARQUE: Un schéma du sérum et le protocole de collecte de CM sans chargeur-est représenté sur la figure 1. 1. Matériaux (Préparation du MEF, Medium, Plaques et Solutions) Préparer 500 ml de milieu de culture les MEF. Supplément milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de FBS (qualité ESC), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine. Isoler MEFs à partir d' embryons suivant un protocole de routine établie 13 et les …

Representative Results

A l' origine, mESCs sont maintenus sur un dispositif d' alimentation en milieu MEF MESC avec du FBS et d' autres suppléments (Figures 1A et 2A). CM ont été recueillies auprès de mESCs réduit Sérum médias sans couche d'alimentation, FBS, ou d' autres suppléments (figures 1B et 2B). Cette condition de culture nous permet de recueillir MESC spécifique milieu conditionné sans contamination poten…

Discussion

Pour le succès de la collecte de sérum et de MESC-CM sans alimentation, les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Le facteur le plus important est l'utilisation précoce mESCs de passage pour la collecte des MESC-CM. Auparavant, il a été montré que le passage précoce MESC-CM a de meilleurs effets anti-âge par rapport à mESCs de passage tardif. Le nombre de passage mESCs a été rapporté à affecter leur potentiel de développement 16 et 17 pluripotence.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par le programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A2060930) et le Programme Medical Research Center (2015R1A5A2009124) par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future. Cette recherche est également soutenu par un démarrage Subvention de fonctionnement de The Hospital for Sick Children (HK Sung). Nous tenons à remercier Laura Barwell et Sarah JS Kim pour leur excellente aide à la rédaction de ce manuscrit et le Dr Andras Nagy pour fournir la ligne G4 MESC.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

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Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

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