Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem
Summary
Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) – und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
Das Ziel dieses Protokolls ist embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM) von serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen zu sammeln und ihre biologischen Funktionen zu charakterisieren.
Im Allgemeinen haben embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ein großes Potential für die regenerative Medizin und Zelltherapie aufgrund ihrer Pluripotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung 1-3. Jedoch hat die direkte Transplantation von Stammzellen mehrere Einschränkungen, wie Immunabstoßung und Tumorbildung 4,5. Daher kann ein zellfreier Ansatz eine alternative therapeutische Strategie für die regenerative Medizin zur Verfügung stellen und Alterungs Interventionen 6,7.
Seneszenz wird als ein zelluläres Pendant zur Alterung von Geweben und Organen betrachtet, von einem permanenten Zustand der Wachstumsarrest, veränderte Zellphysiologie und Verhalten charakterisiert. Altern ist der Hauptrisikofaktor für weit verbreitete Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, typ – 2 – Diabetes und neurodegenerative Krankheit 8. Einer der offensichtlichen Merkmale des Alterns ist der Rückgang der regenerative Potenzial von Geweben, die durch Stammzellalterung und Erschöpfung 9 verursacht wird. Viele Studien haben signifikante pharmakologische Moleküle gezeigt, wie Rapamycin 9, Resveratrol 10 und Metformin 11 und hämatogenen systemische Faktoren, nämlich GDF11 12, die die Fähigkeit haben konsequent Alterung verzögern und die Lebensdauer verlängern.
In der vorliegenden Studie wurde MESC-CM wurde ohne Serum (fötales Rinderserum, FBS) und feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -Schichten geerntet, um die Kontamination von Serumfaktoren und sekretorischen Faktoren von MEFs auszuschließen. Diese Bedingungen erlaubt eine serum-und Feeder-freie CM, die folglich die genaue Identifizierung von MESC spezifischen sekretorischen Faktoren aktiviert.
Diese vorgeschlagene Protokoll ist sehr leistungsfähig, relativ kostengünstig und einfachzu bedienen. Diese Technik liefert einen Einblick in die Charakterisierung von MESC abgeleiteten löslichen Faktoren, die eine anti-Seneszenz Wirkung vermitteln kann, die für die Entwicklung eines sicheren und potenziell vorteilhaft zellfreien therapeutischen Ansatz zur Interventionen für alterungs assoziierten Krankheiten und andere regenerative verwendet werden kann, Behandlungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die erfolgreiche Sammlung von Serum- und Feederfreien MESC-CM, sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. Der wichtigste Faktor ist für die Sammlung von MESC-CM frühen Passage mESCs verwenden. Bisher hat es sich gezeigt, dass eine frühe Passage MESC-CM bessere Anti-Aging-Effekte im Vergleich zu späten Passage mESCs hat. Die Passage Anzahl von mESCs wurde berichtet, ihr Entwicklungspotenzial 16 und Pluripotenz 17 zu beeinflussen.
Während weit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) und dem Medical Research Center-Programm (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung. Diese Forschung wird auch von einem Start-up Betriebskostenzuschuss der Hospital for Sick Children (HK Sung) unterstützt. Wir möchten, dass Laura Barwell und Sarah JS Kim für ihre hervorragende Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. Andras Nagy für die Bereitstellung der G4 MESC Linie zu danken.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
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