Summary

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

Abstract

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Introduction

Poliploid memeli türlerinin özel dokularda değil, aynı zamanda kanser ve dejeneratif hastalıklar gibi patolojik durumlar, çeşitli sadece gözlenmiştir. Polyploid (çoğunlukla tetraploid) hücreleri genellikle serviks 3,4 Barrett özofagus 1,2 veya skuamöz intraepitelyal lezyonlar gibi insan dokularının preneoplastik lezyonlar gözlenir ve bu dokularda 5 malign anöploidi hücrelerin kaynağı olarak kabul edilmiştir 6. o Anöploid hücrelere tetraploid dönüşüm tümörigenezinin erken evrelerinde çok önemli bir olay olabileceğini öne olmasına rağmen, bu süreçte yer alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu dönüştürülmemiş polyploid insan hücreleri yaymak nerede hiçbir in vitro model mevcut olmuştur kısmen çünkü.

Bazı araştırmacılar inh ile binükleer hücrelerin üretilmesi dönüştürülmemiş insan epitel hücrelerinde tetraploidi indüklenensitokinezi 7-9 ibiting. Bu yöntemde, bununla birlikte gereksiz diploit hücreleri 7,8 floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile elimine edilmelidir veya seyreltme 9 sınırlandırılmasıyla klonlama. Bu işlemler gerçekleştirmek için kolay zahmetli ve olmadığından, basit yöntemler dönüştürülmemiş tetraploid hücreler bu alanda araştırma için istenen kurmak.

Bu raporda, biz nispeten basit prosedürlerle normal insan fibroblast veya telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan fibroblastlar gelen proliferatif tetraploid hücreler kurmak için bir protokol açıklar. prosedürler ayrıca DC ile tedavi edilir kapalı sallayarak tarafından toplanan mitoz diploid hücreleri ve mitotik hücrelerin tutuklama mili zehir demekolsin (DC) kullanın. uzun süreli DC ile tedavi diploid mitotik hücreler tetraploid G1 hücrelere dönüştürmek ve bu hücreler ilaç çıkarılmasını takiben birkaç gün süreyle büyüme tutuklanmasının ardından da tetraploid hücreler çoğalırlar. Bu protokol sağlarkromozom istikrarsızlık ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyeli arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir model oluşturmak için etkili bir yöntem.

Protocol

1. Hücre Kültürü Tetraploidi ikna etmek için hücre elde. Bugüne kadar tekniğin insan fibroblast hücre hatları TIG 1, BJ, IMR-90 ve telomeraz-ölümsüzleştirdi TIG-1 (TIG-HT) uygulanabilir olduğu teyit edilmiştir. α değiştirme veya% 10 (h / h)% 5, inkübasyon yolu ile ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (V / ile takviye incelenecek hücre tipi için uygun herhangi bir başka hücre kültür ortamı ile minimum temel ortam içinde hücreler büyümek h) C…

Representative Results

Deneyimlerimize göre, TIG-1 hücreleri, 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC (Şekil 2A) ile birlikte basit sürekli işlenerek hemen hemen tamamen tetraploid yapılabilir. Buna karşılık, BJ ve IMR-90 ve TIG-HT hücreleri gibi diğer fibroblast suşlar, çalkalama kapatma yöntemiyle diploid aynı tedavi sonrası tetraploid popülasyonları ve mitotik hücrelerin izolasyonu bir karışımı olmuştur sırasında gerekli olan (- tedavinin başlamasından sonra 18 saat, genel…

Discussion

kimyasal ajanlarla diploid hücrelerinden tetraploidi indüklenmesinde önemli bir sorun, her iki sitokinez önleyicileri ya da aks önleyicileri, hücreler çoğu zaman, diploid ve tetraploid popülasyonlarının karışımı haline ve tetraploit hücreler diploid hücrelerinden ayrılmalıdır. diploid hücrelerin ücretsiz tetraploid nüfusun izolasyonu için en yaygın yaklaşım, sınırlayıcı seyrelti yoluyla FACS ya klonlamadır. Ancak, bu işlemler zahmetli ve gerçekleştirmek kolay değildir. Bu yazıda, nor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.

Materials

MEM-α Sigma-Aldrich M8042-500ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
FBS Sigma-Aldrich 172012-500ML
Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) Sigma-Aldrich D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits BD Biosciences #340242 For examination of DNA ploidy by flow cytometry
Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte MetaSystems #D-0125-060-DI Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary
Isis imaging system with mFISH  software  MetaSystems Specialized probe kit is necessary

References

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint&#34. J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Play Video

Cite This Article
Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (119), e55028, doi:10.3791/55028 (2017).

View Video