Summary

Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

Abstract

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Introduction

Polyploidie wurde in spezialisierten Geweben von Säugetieren nicht nur beobachtet, sondern auch in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie Krebs und degenerativen Erkrankungen. Polyploiden (meist tetraploid) Zellen werden oft in präneoplastischen Läsionen des menschlichen Geweben beobachtet, wie Barrett-Ösophagus 1,2 oder Plattenepithelkarzinom intraepitheliale Läsionen des Gebärmutterhalses 3,4, und wurden als die Quelle für maligne aneuploid Zellen in diesen Geweben auf 5 , 6. Obwohl vorgeschlagen wird, dass zur Aneuploidzellen Umwandlung von tetraploiden ein entscheidendes Ereignis in den frühen Stadien der Tumorgenese sein könnte, die an diesem Prozess beteiligten Mechanismen sind nicht vollständig verstanden. Dies ist zum Teil , weil keine invitro – Modell verfügbar ist , wo nicht – transformierten polyploid menschlichen Zellen ausbreiten kann.

Einige Forscher haben induzierte Tetraploidie in nicht-transformierten menschlichen Epithelzellen durch Erzeugung von zweikerniger Zellen durch Einwibiting cytokinesis 7-9. In diesem Verfahren muß jedoch unnötige diploiden Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) eliminiert werden 7,8 oder Klonierung durch limitierende Verdünnung 9. Da diese Verfahren mühsam und nicht leicht durchzuführen sind, einfacherer Methoden nicht transformierten tetraploiden Zellen zu etablieren sind für die Forschung auf diesem Gebiet erwünscht.

Im vorliegenden Bericht beschreiben wir ein Protokoll proliferative tetraploiden Zellen von normalen humanen Fibroblasten oder Telomerase-immortalisierten humanen Fibroblasten durch relativ einfache Verfahren zu etablieren. Die Verfahren verwenden Spindelgift Demecolcin (DC) diploiden Zellen in der Mitose und mitotischen Zellen durch Abschütteln gesammelt zu verhaften werden weiter mit DC behandelt. Diploide mitotischen mit DC behandelten Zellen für eine längere Zeit zu tetraploiden G1 Zellen umwandeln, und diese Zellen vermehren als tetraploiden Zellen nach Wachstumsstopp für mehrere Tage nach der Arzneimittelentfernung. Dieses Protokoll siehtein effizientes Verfahren ein nützliches Modell für die Erstellung der Beziehung zwischen Chromosom Instabilität und dem onkogenen Potential der polyploiden menschlichen Zellen zu untersuchen.

Protocol

1. Zellkultur Besorgen Sie sich die Zellen Tetraploidie zu induzieren. Bis heute bestätigt worden, daß diese Technik auf die menschliche Fibroblasten-Zelllinien-TIG 1 angewendet werden kann, BJ, IMR-90 und Telomerase immortalisiert TIG-1 (TIG-HT). Wachsen Zellen in minimalem essentiellem Medium mit α Änderung oder jede andere Zellkulturmedium für den Zelltyp geeignet, um mit 10% (v / v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, untersucht werden, indem in einem 5% (v Inkubieren / …

Representative Results

In unserer Erfahrung können TIG-1 – Zellen für 4 Tage (2A) fast vollständig tetraploid durch einfache kontinuierliche Behandlung mit 0,1 & mgr; g / mL DC erfolgen. Im Gegensatz dazu sind andere Fibroblasten-Stämme, wie BJ oder IMR-90 und TIG-HT-Zellen, wurde ein Gemisch aus diploid und tetraploid Populationen nach der gleichen Behandlung, und zur Isolierung von mitotischen Zellen von der shake-off-Verfahren ist notwendig, während des Verlaufs Gleichbehandlung ( …

Discussion

Ein Hauptproblem bei der Induktion von Tetraploidie von diploiden Zellen, die durch chemische Mittel, entweder durch Zytokinese Inhibitoren oder durch Spindelinhibitoren, ist, dass die Zellen häufig eine Mischung aus diploide und tetraploide Populationen werden und tetraploiden Zellen müssen von diploiden Zellen getrennt werden. Die häufigsten Ansätze zur Isolierung einer tetraploiden Bevölkerung verwenden frei von diploiden Zellen FACS oder Klonierung durch limitierende Verdünnung. Jedoch sind diese Verfahren mü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.

Materials

MEM-α Sigma-Aldrich M8042-500ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
FBS Sigma-Aldrich 172012-500ML
Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) Sigma-Aldrich D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits BD Biosciences #340242 For examination of DNA ploidy by flow cytometry
Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte MetaSystems #D-0125-060-DI Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary
Isis imaging system with mFISH  software  MetaSystems Specialized probe kit is necessary

References

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint&#34. J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

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Cite This Article
Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (119), e55028, doi:10.3791/55028 (2017).

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