Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

MS ist eine menschliche Krankheit durch eine chronische Entzündung und Neurodegeneration des ZNS charakterisiert, die in Richtung Myelin gerichtet durch eine Autoimmunreaktion angetrieben wird gedacht werden. Der Verlust von Myelin und Axonen im Laufe der Zeit führen zur allmählichen Rückgang der kognitiven und motorischen Funktion ^1. "Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis" ist ein Oberbegriff für Tiermodellen von Autoimmunkrankheit zu CNS Myelin gerichtet. Wie menschliche MS wird EAE typischerweise durch Immunzellinfiltration des ZNS gekennzeichnet und in einigen Fällen Demyelinisierung ^2. Um jedoch zu der Grad zu einem gegebenen EAE-Modell menschlichen MS teil ähnelt, hängt von der Spezies oder Stamm verwendet und von der Komplexität der zugrunde liegenden anti-Myelinautoimmunreaktion.

Anti-Myelin-Autoimmunität kann experimentell auf verschiedene Weise hervorgerufen werden, aber die am häufigsten verwendete Methode ist heute Mäuse mit einem kurzen Peptid von Aminosäuren zu immunisieren, die immunodominante CD4 nachahmen <soben> + T – Zell – Epitop eines Myelinprotein. Dies stellt die Mindestanforderung eine pathogene Reaktion zu induzieren. Vielleicht die häufigste von diesen ist ein 21 Aminosäure-Peptid , das von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein abgeleitet ist (MOG _35-55), die EAE verwendet wird , ³ in C57BL / 6 – Mäusen zu induzieren. Jedoch für einige experimentelle Zwecke ist es wünschenswert oder sogar notwendig, mit größeren Proteinantigenen zu immunisieren und tatsächlich gibt mehrere Vorteile dieses über Immunisierung mit kurzen Peptid. Erstens, weil der MHC-Restriktion, sind kurze Peptide Regel nur dann wirksam, in einem sehr begrenzten Bereich von Spannungen, während größere Proteinantigene, entweder das gesamte Protein oder einen bestimmten Domäne darstellt normalerweise in mehreren Inzuchtmäusestämmen zur Präsentation verarbeitet werden kann, oder sogar in anderen Spezies ^4. Zweitens ist ein größeres Protein-Antigen in der Lage, eine komplexere Immunantwort enthält mehrere Arten von Lymphozyten in Antigenerkennung induzierende, anstatt limiting Antigen – Erkennung an CD4 ⁺ T – Zellen. Beispielsweise B-Zellen über den B-Zell-Rezeptor (BCR) interagieren direkt mit ganzen nicht prozessierten Proteins. Wir und andere haben gezeigt, dass B – Zellen durch MOG _35-55 Immunisierung aktiviert gezeigt nicht erkennen MOG – Protein ^5. Da B – Zellen ^6, die vor kurzem in der menschlichen MS gezeigt wurden Modelle EAE eine pathogene Rolle zu spielen , die B – Zellen bei Autoimmunpathologie integrieren zunehmend an Bedeutung gewinnen .

Trotz der Vorteile der größeren Protein-Antigene unter Verwendung von EAE zu induzieren, bleiben einige im Handel erhältliche Quellen für solche Proteine. Tatsächlich, während kurze Peptide wie MOG _35-55 sehr schnell synthetisiert werden kann und bei relativ niedrigen Kosten, die kommerziellen Möglichkeiten für MOG Proteins sind begrenzt und die Kosten wesentlich zu erwerben. Dennoch gibt es mehrere Expressionsvektoren für Forschungsgruppen verfügbar MOG extrazelluläre Domäne (MOG _1-125) selbst zu erzeugen. However, alle der Expressionssysteme, die in der Literatur identifiziert worden sind , auf älteren Technologien basieren , die seit mit effizienter Expressionssysteme ⁷ ersetzt wurden. Ferner sind die meisten ⁸ basierend auf Ratten- oder menschlichen MOG. Für einige Untersuchungen der Autoimmunität bei Mäusen, ein Antigen auf der Maus MOG Autoantigen basiert, ist bevorzugt. Schließlich werden alle MOG-basierten Proteine , die wir identifiziert haben, entweder kommerziell oder als Expressionsvektoren, Fusionsproteine zusätzliche Aminosäuren zum MOG _1-125 Base enthält. Dazu gehören ein Tag für die Reinigung und in der Regel andere Sequenzen als auch, von denen viele mit einer Funktion, die wir nicht in der Lage waren, zu identifizieren.

Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir einen für ein Protein neuartige Fusion basiert auf der Maus MOG extrazelluläre Domäne an einen Tag fusionierten thioredoxin mit dem bekannten Unlösbarkeit von MOG – Protein ⁵ zu bekämpfen. Die Tag-Sequenz enthält auch eine 6xHis-Sequenz für die Reinigung und eine TEV-Protease cleAvage Seite, die für die vollständige Entfernung aller Tag-Sequenzen ermöglicht, falls gewünscht. Dies ist die einzige Methode , die wir kennen reinen MOG _1-125 Protein zu erzeugen. Zur Produktion großer Mengen an Protein zu erleichtern, wurde die MOG _1-125 – Sequenz für die bakterielle Expression-Kodon – optimierten und das MOG – _Tag – Fusionsprotein wurde in den pET-32 – Expressionssystem eingesetzt wird . Hier beschreiben wir ausführlich in das Protokoll zu erzeugen und MOG – _Tag – Protein zu reinigen und rein MOG _1-125, mit nicht spezialisierten Ausrüstung zur Verfügung zu den meisten Immunologie Laboratorien.