Summary

إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

Published: October 27, 2016
doi:

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

التصلب العصبي المتعدد هو مرض يصيب الإنسان تتميز التهاب مزمن والتنكس العصبي للجهاز العصبي المركزي والتي يعتقد أن تكون مدفوعة من قبل رد فعل المناعة الذاتية الموجهة نحو المايلين. فقدان المايلين ومحاور مع مرور الوقت تؤدي إلى الانحسار التدريجي لالمعرفية والحركية وظيفة 1. "التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ" هو مصطلح شامل لنماذج حيوانية من أمراض المناعة الذاتية الموجهة نحو الجهاز العصبي المركزي المايلين. مثل MS الإنسان، وعادة ما يتميز EAE بواسطة تسلل الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي، وفي بعض الحالات، إزالة الميالين 2. ومع ذلك، فإن الدرجة التي تشبه أي نموذج EAE نظرا MS البشري في جزء يعتمد على نوع أو سلالة المستخدمة وعلى مدى تعقيد استجابة المناعة الذاتية الكامنة مكافحة المايلين.

المناعة الذاتية مكافحة الميلين يمكن أن يتسبب تجريبيا في العديد من الطرق، ولكن الأسلوب الأكثر شيوعا اليوم هي لتحصين الفئران مع الببتيد قصيرة من الأحماض الأمينية محاكاة CD4 سائد مناعيا <sتصل> + الخلايا التائية حاتمة للبروتين النخاعين. وهذا يمثل الحد الأدنى المطلوب للحث على الاستجابة المسببة للأمراض. ولعل الأكثر شيوعا من هذه هو الببتيد حمض أميني 21 مشتقة من بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG 35-55)، والذي يستخدم للحث على EAE في C57BL / 6 الفئران 3. ومع ذلك، بالنسبة لبعض أغراض تجريبية من المرغوب فيه أو حتى من الضروري تحصين مع مستضدات بروتين أكبر وبالفعل هناك العديد من المزايا لهذا على تحصين مع الببتيد قصيرة. أولا، بسبب تقييد MHC، الببتيدات قصيرة وعادة ما تكون فعالة إلا في نطاق محدود جدا من السلالات، بينما أكبر مستضدات البروتين تمثل إما البروتين الكامل أو مجال معين يمكن معالجة عادة لعرضها في عدة سلالات الفئران الفطرية أو حتى في أنواع مختلفة 4. ثانيا، مستضد بروتين أكبر قادر على إحداث استجابة مناعية أكثر تعقيدا تضم ​​أكثر من أنواع الخلايا الليمفاوية في الاعتراف مستضد، بدلا من limitinز مستضد الاعتراف لخلايا CD4 + T. على سبيل المثال، الخلايا البائية عبر من مستقبلات الخلايا البائية (BCR) تتفاعل مباشرة مع كامل بدلا من معالجتها البروتين. نحن وآخرون قد أظهرت أن الخلايا البائية تفعيلها من خلال MOG 35-55 التحصين لا تعترف البروتين MOG 5. منذ تجلت الخلايا البائية مؤخرا للعب دور الممرضة في MS البشري نماذج EAE التي تتضمن الخلايا البائية في أمراض المناعة الذاتية هي ذات أهمية متزايدة.

وعلى الرغم من مزايا استخدام المضادات البروتين أكبر للحث على EAE، لا تزال هناك بعض المصادر المتاحة تجاريا لهذه البروتينات. في الواقع، في حين أن الببتيدات القصيرة مثل MOG 35-55 يمكن توليفها بشكل سريع جدا وبتكلفة منخفضة نسبيا، والخيارات التجارية للبروتين MOG محدودة والتكلفة إلى حد كبير أكثر لشراء. ومع ذلك، هناك العديد من ناقلات التعبير المتاحة للمجموعات بحثية لتوليد MOG نطاق خارج الخلية (MOG 1-125) أنفسهم. Howeveص، وتقوم كل الأنظمة التعبير التي حددناها في الأدب على التقنيات القديمة التي منذ تم استبدال أنظمة التعبير أكثر كفاءة 7. وعلاوة على ذلك، تعتمد في الغالب على الفئران أو الإنسان MOG 8. بالنسبة لبعض التحقيقات من المناعة الذاتية في الفئران، مستضد على أساس مستضد ذاتي الماوس MOG هو الأفضل. وأخيرا، جميع البروتينات على أساس MOG التي حددناها، سواء التجارية أو ناقلات التعبير، هي البروتينات الانصهار التي تحتوي على الأحماض الأمينية إضافية إلى قاعدة MOG 1-125. وتشمل هذه شعارا لتنقية وتسلسل عادة أخرى أيضا، وكثير منها مع وظيفة لم نتمكن من التعرف عليها.

لمعالجة هذه القيود، ولدت لنا بروتين الانصهار رواية تقوم على الماوس MOG نطاق خارج الخلية لتنصهر علامة تحتوي على thioredoxin لمكافحة الذوبان معروفة من البروتين MOG 5. يحتوي على تسلسل العلامة أيضا تسلسل 6xHis لتنقية والبروتياز شركة كلي TEVموقع avage التي تسمح لإزالة كاملة من جميع تسلسل علامة، إذا رغبت في ذلك. هذا هو الأسلوب الوحيد الذي ندرك لتوليد النقي MOG 1-125 البروتين. لتسهيل إنتاج كميات كبيرة من البروتين، وتسلسل MOG 1-125 كان كودون الأمثل للتعبير عن البكتيريا وتم إدراج MOG البروتين العلامة الاندماج في النظام التعبير PET-32. هنا، نحن تصف بالتفصيل بروتوكول لإنتاج وتنقية MOG العلامة البروتين، وزارة النفط والغاز النقي 1-125، وذلك باستخدام المعدات غير المتخصصة المتاحة لمعظم مختبرات علم المناعة.

Protocol

1. البروتين التعريفي ملاحظة: في الخطوات التالية، BL21 القولونية بكتيريا القولونية تحولت مع ناقلات PET-32 التي تحتوي على تسلسل للبروتين العلامة MOG الانصهار (انظر المرجع 5) والشكل (1) تزرع على كثافة عالية ومن …

Representative Results

مرة واحدة في تنقية كاملة، والعينات التي تم جمعها في الخطوات 1.4، 2.1، 3.4، ويجب أن يتم تشغيل المنتج النهائي من الخطوة 6.4 على هلام بروتين (الشكل 3A). العلامة MOG يجب أن تظهر أولا والفرقة كيلو دالتون 31.86 في العينة T O / N، ولكن ليس ر 0، وي…

Discussion

هنا، التي وصفناها بروتوكول لإنتاج MOG البروتين العلامة وكيفية توليد MOG النقي 1-125 من البروتين العلامة MOG. ويستند هذا البروتوكول على حد سواء على أساس طرق تنقية البروتين القياسية صاحب العلامة، وكذلك بروتوكول سبق وصفها لتوليد البروتين كبار السن على أساس …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
  10. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Play Video

Cite This Article
Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

View Video