Summary

Generating<em> De Novo</em> Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Published: October 25, 2016
doi:

Summary

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Abstract

T-celreceptoren (TCR's) worden klinisch gebruikt om de specificiteit van T-cellen direct naar tumoren te richten als een veelbelovende modaliteit van immunotherapie. Daarom heeft TCRs klonen specifiek voor verschillende tumor-geassocieerde antigenen het doel van vele studies. Een effectieve T-cel op te wekken, moet de TCR het doelantigeen optimale affiniteit herkennen. Echter, klonen dergelijke TCRs uitdaging en vele beschikbare TCRs geweest bezitten suboptimaal affiniteit voor de verwante antigeen. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het kloneren van de novo hoge affiniteit antigeenspecifieke TCRs Bestaande TCRs door gebruik hemichain centricity. Het is bekend dat sommige TCRs, elk TCRα of TcR hemichain niet gelijk bijdragen aan antigeen herkenning, en de dominante hemichain wordt aangeduid als centraal hemichain. We hebben aangetoond dat door het koppelen van de centrische hemichain met tegenstroom ketens verschillen van de oorspronkelijke contra-keten, kunnen wij het antigeen en handhavenpecificity, terwijl de interactie moduleren kracht voor de verwant antigeen. Aldus kan het therapeutisch potentieel van een bepaalde TCR worden verbeterd door het optimaliseren van de koppeling tussen de centrische en tegen hemichains.

Introduction

T-celreceptoren (TCR's) zijn heterodimere adaptieve immuun receptoren door T-lymfocyten tot expressie gebracht, bestaande uit een TCRα en TcR keten. Ze optreden via somatische herschikking van V (D) J-gensegmenten, die een zeer divers repertoire kan herkennen vrijwel onbegrensde configuratie van HLA / peptide-complexen produceert. Klinisch T cellen ontworpen om clonotypic TCRs die specifiek zijn voor met tumor geassocieerde antigenen tot expressie aangetoond werkzaamheid bij verschillende kankers 1. Veel TCRs gekloneerd hiertoe onvoldoende affiniteit voor het antigeen van belang, waardoor hun therapeutische toepassing te beperken.

We beschrijven een werkwijze om deze beperking te overwinnen bestaande TCRs door gebruik keten centricity. Vermeld is dat een TCR hemichain een dominante rol in herkenning van het doelantigeen 2 kan spelen, hier genoemd centraal stellen. Crystal structurele analyses blijkt dat een centraalhemichain van een TCR kan verantwoordelijk voor het merendeel van de voetafdruk op het MHC / peptidecomplex 3,4. Dit begrip te gebruiken, hebben we eerder aangetoond dat het SIG35α TCRα kan koppelen met een divers repertoire van TcR ketens en onderhouden reactiviteit tegen MART1 27-35 peptide gepresenteerd door HLA-A2 5. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de TCR TAK1, waarbij de centrische TcR hemichain gekoppeld aan allerlei TCRα ketens en onderhouden reactiviteit voor WT1 235-243 peptide gepresenteerd door HLA-A24 6. Zowel MART1 en WT1 zijn tumor-geassocieerde antigenen. Chain-centricity werd ook toegepast op antigeen erkenning van CD1d-beperkte invariante natural killer (iNKT) TCR's te bestuderen, door het koppelen van de invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα keten van humaan iNKT TCR's met verschillende Vβ11 TcR ketens 7.

In alle gevallen konden we een de novo repertoire van TCRs genereren van transducing de centric TCR hemichain perifere bloed T-cellen, waarbij het ingebrachte hemichain gepaard met de endogene TCRα of TcR contra-ketens. In wezen centric hemichain dient als lokaas die kan worden gebruikt om de juiste contra-ketens, die bij elkaar gekoppelde vormen TCRs die de antigeenspecificiteit van belang, maar variërend in affiniteit te identificeren. Van deze nieuwe repertoires, waren we in staat om clonotypic TCR's te isoleren met een verbeterde interactie sterkte tegen het doelantigeen in vergelijking met reeds bestaande TCR's. Daarom geloven wij deze methode zal de pijpleiding identificeren optimale TCR's voor klinische toepassing te versnellen.

Protocol

1. Voorbereiding Retrovirale Construct Encoding TCR Hemichain Interessante Lineariseren PMX vector de insertie van een TCR gen in opeenvolgende stappen laten. Digest het plasmide DNA met EcoRI en NotI restrictie-enzymen bij 37 ° C gedurende 3 uur (Tabel 1) 8. Het uitvoeren van elektroforese van de verteerde plasmide op 1,2% agarosegel. Accijnzen band van ongeveer 4500 basenparen (bps) en elueren in 30 ul steriel water met behulp van commercieel verkrijgbare gel extractie…

Representative Results

Zonder voorkennis waarvan hemichain is keten-centric, de TCRα en TcR keten afzonderlijk worden gekloneerd en getransduceerd perifere bloed T-cellen, die werd uitgevoerd bij HLA-A24 / WT1 reactieve TAK1 TCR (figuur 1). Transductie van TAK1β leverde een aanzienlijk hogere frequentie van antigenspecifieke T-cellen. Omgekeerd transductie van een non-centric hemichain niet op de novo multimeer positieve T-cellen, zoals gezien met TAK1α keten (figuur 1).</s…

Discussion

De eerste vereiste voor succesvolle toepassing van deze werkwijze is het bereiken van voldoende transductie efficiëntie van de primaire T-cellen met de hemichain plaats. In onze ervaring, de combinatie van het gebruik van PG13 als verpakkingscellijn en retrovirale vector pmx als resultaten in een stabiele en efficiënte expressie van het geïntroduceerde gen in primaire T-cellen. PG13 packaging cellen kunnen eencellige gekloond om te selecteren op hoge titer inpakcellen transductie efficiëntie verbeteren. Bovendien is…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL
293GPG cells Generated by Ory et al. (ref 8)
Agar Wisent Bioproducts 800-010-CG
Agarose Wisent Bioproducts 800-015-CG
Ampicillin sodium salt Wisent Bioproducts 400-110-IG
Chloroform BioShop CCL402
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995065
EcoRI New England Biolabs R0101S
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483020
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Filter Corning 431220 0.45 mm pore SFCA membrane
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb Biolegend 345104 clone ME20.4
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb Biolegend 300440 clone UCHT1
Gentamicin Life Technologies 15750078
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs E2611L used for multi-piece DNA assembly
HLA-A2 pentamer Proimmune depends on antigenic peptide HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune
HLA/CD1d monomers NIH Tetramer Core Facility multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
human CD3 microbeads Miltenyi Biotec 130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit Beckman Coulter IM3497
Jurkat 76 cells Generated by Heemskerk et al. (ref 10)
LB Broth Wisent Bioproducts 800-060-LG
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
NEB 5-alpha Competent E. coli New England Biolabs C2987I
NEBuffer 3.1 New England Biolabs B7203S used for EcoRI and NotI digestion
NotI New England Biolabs R0189S
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410 used for plasmid purification
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb Beckman Coulter B21205 clone B9.11
PG13 cells ATCC CRL-10686
Phusion HF Buffer Pack New England Biolabs B0518S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
pMX retroviral vector Cell Biolabs RTV-010
polybrene Sigma-Aldrich H-9268
Proleukin (recombinant human interleukin-2) Novartis by Rx only equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich
Purified anti-human CD3 antibody Biolegend 317301 clone OKT3, used for T cell stimulation
RPMI 1640 Life Technologies 11875119
SA-PE Life Technologies S866 used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility
SMARTer RACE 5'/3'  Kit Clontech 634858
Sterile water Wisent Bioproducts 809-115-LL
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen 18080051 for cDNA synthesis
Syringe BD 301604 10 mL, slip tip
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660
TransIT-293 Mirus Bio MIR 2700 used to transfect 293GPG cells
TRIzol Reagent Life Technologies 15596026

References

  1. Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
  2. Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
  3. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
  4. Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
  5. Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
  6. Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
  7. Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
  8. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
  9. Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
  12. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
  13. Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
  14. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  15. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  16. Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
  17. Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
  18. Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
  19. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
  20. Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
  21. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  22. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
  23. Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
  24. Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
  25. Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
  26. Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
  27. Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
  28. Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
  29. Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
  30. Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).

Play Video

Cite This Article
Guo, T., Ochi, T., Nakatsugawa, M., Kagoya, Y., Anczurowski, M., Wang, C., Rahman, M. A., Saso, K., Butler, M. O., Hirano, N. Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain. J. Vis. Exp. (116), e54697, doi:10.3791/54697 (2016).

View Video