Générateur<em> De Novo</em> Spécifiques de l'antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain
Summary
Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.
Abstract
Les récepteurs des cellules T (TCR) sont utilisés cliniquement pour diriger la spécificité des lymphocytes T à cibler des tumeurs en tant que modalité prometteuse de l'immunothérapie. Par conséquent, le clonage des TCR spécifiques de divers antigènes associés à des tumeurs a été l'objectif de nombreuses études. Pour provoquer une réponse efficace des lymphocytes T, le TCR doit reconnaître l'antigène cible avec une affinité optimale. Cependant, le clonage tel TCR a été un défi et beaucoup disponibles TCR possèdent une affinité sous-optimale pour l'antigène correspondant. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de clonage de novo TCR spécifiques de l'antigène à haute affinité en utilisant des TCR existants en exploitant hemichain centricity. Il est connu que pour certains TCR, chacun TCRa ou TCRβ hemichain ne contribuent également à la reconnaissance de l'antigène, et le hemichain dominant est désigné sous le nom hemichain centrée. Nous avons montré que par l'appariement du hemichain centric avec des contre-chaînes différentes de la contre-chaîne d'origine, nous sommes en mesure de maintenir l'antigène specificity, tout en modulant sa force d'interaction pour l'antigène correspondant. Ainsi, le potentiel thérapeutique d'un TCR donné peut être améliorée en optimisant l'appariement entre les centriques et la contre-hemichains.
Introduction
Les récepteurs des cellules T (TCR) sont des récepteurs immunitaires adaptatives hétérodimères exprimés par les lymphocytes T, constitués d'une chaîne TCRa et TCRβ. Elles sont produites par un réarrangement somatique de V (D) des segments de gène J, qui produit un répertoire très diversifié capable de reconnaître des configurations pratiquement illimitées de complexes HLA / peptide. Cliniquement, les cellules T modifiées pour exprimer clonotypique spécifiques des TCR pour des antigènes associés à une tumeur ont montré une efficacité dans une variété de cancers 1. Cependant, de nombreux clones de TCR à cet effet, ne disposent pas une affinité suffisante pour l'antigène d'intérêt, ce qui limite leur application thérapeutique.
Ici, nous décrivons une méthode pour surmonter cette limitation pour les TCR existants en exploitant la chaîne Centricity. Il a été rapporté que l' un hemichain TCR pourrait jouer un rôle plus important dans la reconnaissance de l'antigène cible 2, appelé ici centricity. analyses structurales de Crystal ont montré que l'une centréehemichain d'un TCR pourrait représenter la majorité de l'empreinte sur le CMH / peptide complexe 3,4. En utilisant ce concept, nous avons déjà démontré que le SIG35α TCRa peut jumeler avec un répertoire varié de chaînes TCRβ et maintenir la réactivité contre le peptide MART1 27-35 présenté par HLA-A2 5. Des résultats similaires ont été obtenus avec le RCT TAK1, où le hemichain TCRβ centré sur apparié avec différentes chaînes TCRa et maintenu la réactivité du peptide 235-243 WT1 présenté par HLA-A24 6. Deux MART1 et WT1 sont des antigènes associés aux tumeurs. Chain-centricity a également été appliquée à l' étude reconnaissance de l' antigène des cellules tueuses naturelles (iNKT) TCR invariants CD1d-restreintes, en associant l'invariant chaîne Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRa des TCR iNKT humaines avec différentes chaînes Vβ11 TCRβ 7.
Dans tous les cas, nous avons été en mesure de générer un répertoire de novo de TCR par transduction du TCR hemichain centrée sur les cellules T du sang périphérique, où le hemichain introduit jumelé avec le TCRa endogène ou TCRβ contre-chaînes. En substance, la hemichain centrée sert d'appât qui peut être utilisé pour identifier les contre-chaînes appropriées, qui forment ensemble une fois appareillé TCR qui maintiennent la spécificité de l'antigène d'intérêt, mais variant d'affinité. De ces nouveaux répertoires, nous avons été en mesure d'isoler TCR clonotypiques avec une meilleure résistance à l'interaction contre l'antigène cible par rapport à TCR pré-existantes. Par conséquent, nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer le pipeline d'identifier les TCR optimales pour l'application clinique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La première exigence pour une bonne application de ce procédé réalise l'efficacité de transduction suffisante de cellules T primaires avec le hemichain d'intérêt. Dans notre expérience, la combinaison de l'utilisation de PG13 comme lignée cellulaire d'emballage et pMX que les résultats de vecteurs rétroviraux dans l'expression stable et efficace du gène introduit dans les cellules T humaines primaires. les cellules d'emballage PG13 peuvent être une seule cellule clonée pour sélecti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
