موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
يحدث تنشيط جهاز المناعة في أمراض الكلى متعددة والعمليات الفيزيولوجية المرضية 6،10،11،13. المجالات المحتملة للأبحاث نشطة تشمل محفزات مختلفة لتنشيط الجهاز المناعي، ومختلف أنواع الخلايا المعنية، ونمط خلوى / chemokine في وضع مرض معين، تعديل من جميع العمليات الآنفة الذكر التي دواء معين وما إلى ذلك مثالا، في نقص التروية ضخه إصابة (نموذج لقصور كلوي حاد)، أن هناك زيادة في الخلايا المناعية أو النخاع العظمي المستمدة الخلايا المكونة للدم أو CD45 + الخلايا في غضون ساعات قليلة، والذي أصيب خلال الفترة من إصلاح أو التليف (بعد 6 أسابيع) 5، 12. هذه الخلايا المناعية تفرز كل من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات ومضادة للالتهابات لتنظيم عملية إصلاح 5،12. حاليا، قد زاد من القدرة على استخدام fluorophores متعددة في وقت واحد لتسمية السكان الخلية في تعليق خلية واحدة مع الإعلانتنفيس عن تدفق الحديث الخلوي الأجهزة مع 4-5 الليزر. وقد أضاف هذا إلى حد كبير في القدرة على تمييز السكان الخلية على أساس حالتها التشغيلية 3،7. على سبيل المثال، لتسمية بدقة بلعم منخفضة، ستكون هناك حاجة F4 / 80 منخفضة CD11b عالية Ly6b CD206 ارتفاع لا يقل عن 3 المزيد من fluorophores في حجم العينة نفسه إلى بوابة للخلايا الحية، CD45 + (الكريات البيضاء) وLy6G- (العدلات) و هذا ممكن إلى حد كبير مع أحدث تدفق Cytometers 3. ومع ذلك، فإن المقايسات المصب لإفراز السيتوكينات، تكاثر الخلايا، سمية الخلايا، وتفعيل البلاعم والكمي لأعداد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا اللمفية وحيدات لا يحتاج فقط نوعية جيدة (خلايا حية، singlets ل) ولكن أعداد كافية من الخلايا.
ويتكون نظام المناعة في الكلى تتكون من كل من مكونات التكيف والفطرية وأنواع خلايا متعددة 1،7،13. على سبيل المثال، في الفئران طفل اثنينneys يتم الإبلاغ معا لاحتواء 2-17٪ (28،000-266،000) CD45 + الخلايا من الخلايا المناعية مجموع الكلى معزولة (1.4 × 10 6 خلايا) وحوالي 5-15٪ (1،400-4،200) هذه هي خلايا CD4 + 1 ، 5،12. وهناك نسبة صغيرة (5-15٪، 70-630) من هذه CD4 + الخلايا FoxP3 + الخلايا (الشكل 1) 1. ونتيجة لهذه التخفيضات خطوة حكيمة في النسب المئوية للخلايا، وأحيانا السكان خلية من الاهتمام (في هذه الحالة CD45 + CD4 + FoxP3 + الخلايا) يمثله مجرد ~ 100 خلية. عدد قليل من CD45 + CD4 + FoxP3 + خلايا يحتم أن عددا كبيرا من مجموع الخلايا يتم عزل والخلايا هي من نوعية جيدة للدراسات المصب مثل المقايسات خلوى إفراز. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الضروري الجمع بين الكليتين 2-3 الفئران منذ لا يتم تمثيل مجموعات سكانية فرعية بأعداد كبيرة كافية لتنفيذ فحوصات قياس الكمي. وبالتالي، العزلة موثوقة وفعالة للسكان الخلية وحيدة النواة الكلى أمر مرغوب فيه من أجل عشيقذ الطيف المناعية المرتبطة أمراض الكلى.
تقليديا، لعزل الخلايا وحيدة النواة الكلى، وقد استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من الهضم الأنزيمية مثل كولاجيناز 1A أو الثاني بما في ذلك الدناز 1 1،5،12. ومن المعروف جيدا أن collagenases يكون النشاط الأنزيمي أن يختلف مع الأرقام كثيرا، ومن قبل شركة التصنيع، مما استلزم المعايرة للتركيز الأمثل ومدة الحضانة 4،14،15. وبالإضافة إلى ذلك، والهضم مع كولاجيناز يضيف الوقت لتنميق الكلى إلى قطع صغيرة، يتطلب الحضانة من القطع الكلى في (37 درجة مئوية) حمام ساخن وقتا إضافيا للحضانة في EDTA لوقف التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق أقل العقم لبعض الإجراءات اللاحقة التي تحتاج إلى زراعة الخلايا. الأهم من ذلك، اعتمادا على المحقق وجميع المتغيرات التي تنطوي عليها، فإنه يؤدي إلى التباين في البيانات وتفسيرها عبر المختبرات. في الآونة الأخيرة، معتطوير الميكانيكية الأنسجة اختلال / المجانسة 16، يتم تجنب خطوة كولاجيناز الهضم تماما والاستعاضة عن تعطل ميكانيكية بسيطة الكلى 2. هنا، علينا أن نظهر طريقة كفؤ بسيط لعزل الخلايا المناعية الكلى للاستخدام اليومي استخراج الخلايا المناعية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع الأنسجة الرخوة وغير ليفية أخرى مثل الكبد والدماغ 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قدمنا هنا منهجية للحصول على خلايا المناعة من الكلى بطريقة موثوقة وفعالة. تعديل رئيسي إلى الخطوة كولاجيناز الهضم المستخدمة على نطاق واسع (اضطراب الميكانيكية من الأنسجة) يوفر حوالي 30 دقيقة، ويأخذ عزل عدد كبير من الخلايا المناعية قابلة للحياة اقل من ساعتين لمدة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
