Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

A activação do sistema imunitário ocorre em várias doenças renais e processos patofisiológicos ^6,10,11,13. As áreas potenciais de investigação activa abranger os vários disparadores para a activação do sistema imunológico, vários tipos de células envolvidos, o padrão de citocinas / quimiocina num ambiente doença em particular, a modulação de todos os processos acima mencionados por um determinado medicamento, etc. Para exemplificar, na isquemia-reperfusão lesão (um modelo de lesão renal aguda), há um aumento em células imunitárias ou de medula óssea derivada de células hematopoiéticas ou CD45 ⁺ células dentro de algumas horas, que é sustentado ao longo do período de conservação ou fibrose (6 semanas mais tarde) ^{5, 12.} Estas células imunitárias segregam ambas as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e quimiocinas para orquestrar o processo de reparação ^5,12. Actualmente, a capacidade para utilizar vários fluoróforos simultaneamente para rotular populações de células numa suspensão de células individuais aumentou com o anúncioventilação de fluxo moderno citometria de máquinas com quatro a cinco lasers. Isto tem substancialmente adicionada à capacidade para discriminar as populações de células com base no seu estado funcional ^3,7. Por exemplo, ao etiquetar com precisão um macrófago como F4 / 80 ^{Baixo Alto Alto} CD206 Ly6b CD11b ^baixa, pelo menos mais 3 fluoróforos seria necessário no mesmo volume de amostra a porta para as células vivas, CD45 + (leucócitos) e Ly6G- (neutrófilos) e isso é muito possível com o novo fluxo Citómetros ^3. No entanto, os ensaios a jusante para a secreção de citoquina, proliferação celular, a citotoxicidade, a activação de macrófagos e a quantificação dos números de vários subconjuntos de linfócitos e monócitos não só precisa de boa qualidade (células vivas, singuletos) mas um número adequado de células.

O sistema imunológico no rim, é constituído por dois componentes de adaptação e inatas e vários tipos de células ^1,7,13. Por exemplo, em ratinhos a dois miúdo⁺ células Neys juntos são relatados para conter 2-17% (28,000-266,000) CD45 das células do sistema imune de rim total isolado (1,4 x 10 ⁶ células) e cerca de 5-15% (1,400-4,200) destes são células CD4 ^{+ 1 , 5,12.} Uma pequena percentagem (5-15%, 70-630) destas células CD4 + são FoxP3 + células (Figura 1) ^1. Devido a estas etapa reduções sábios em percentagens de células, por vezes, a população de células de interesse (neste caso CD45 + CD4 + Foxp3 + células) é representado por um simples ~ 100 células. O pequeno número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + torna imperativo que um grande número de células totais são isoladas e as células são de boa qualidade para estudos a jusante, tais como ensaios de secreção de citocinas. Além disso, pode ser necessário combinar rins 2-3 murganhos uma vez que as subpopulações não são representados em número suficiente altos para realizar ensaios quantificáveis. Por isso, o isolamento fiável e eficaz de populações de células mononucleares do rim é desejável, a fim de estuy o espectro imunológicas associadas com doenças renais.

Tradicionalmente, para o isolamento de células mononucleares de rim, os investigadores têm usado uma variedade de digestões enzimáticas, tais como a colagenase 1A ou II, incluindo ADNase 1 ^1,5,12. É bem sabido que as colagenases têm actividade enzimática que varia de acordo com os números de lote e pela empresa de fabrico, necessitando de titulação para a concentração óptima e a duração da incubação ^4,14,15. Além disso, a digestão com colagenase adiciona tempo para picagem do rim em pedaços pequenos, requer a incubação dos pedaços de rim em A (37 ° C), banho de aquecimento e um tempo adicional para a incubação em EDTA para parar a reacção. Além disso, a menos que a esterilidade pode ser conseguido por alguns processos a jusante que necessitam de cultura de células. Mais importante ainda, dependendo do investigador e todas as variáveis ​​envolvidas, que conduz a variabilidade dos dados e interpretação entre laboratórios. Recentemente, com adesenvolvimento de tecido mecânicos / disruptores homogeneizadores ^16, a etapa de digestão de colagenase é completamente evitados e substituídos por uma ruptura mecânica simples dos rins ^2. Aqui, nós demonstramos um método simples mas eficaz para o isolamento de células do sistema imunológico nos rins para extrações de células imunes diárias. Mais importante, esta técnica pode ser adaptado para outros tecidos moles e não fibrosos, tais como o fígado e o cérebro ^16.