Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
İnsanlarda ve farelerde T hücresi reseptörü (TCR) repertuarı 1 x 10 8 ve 2 x 10 6 benzersiz TCRler, sırasıyla 1,2 olarak tahmin edilmiştir. Bu büyük çeşitlilik T hücreleri kendi peptidlerinin yanı sıra antijen sunan hücreler (APC'ler) üzerindeki majör histokompatibilite kompleksiyle (MHC) tarafından sunulan patojenlerden türetilmiş antijen epitop geniş bir dizi tanımasını sağlar. Benzersiz peptid-MHC komplekslerine sahip TCRlerin etkileşimleri ince farklar T hücre apoptosis, anerji, aktivasyon, farklılaşma, sitokin üretiminin veya sitotoksisite tabi olup olmadığını belirler. Bununla birlikte, büyük bir TCR repertuarına, belirli bir TCR belirli bir antijene yanıt nasıl analizi, tek TCR sistemlerinin kullanılmasını gerektirir.
Çeşitli TCR transjenik farenin bir in vivo modeli 3-9 tek TCR'nin fonksiyonu çalışma amacıyla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, aşağıdakileri içeren transgenik fareler TCR'ye uyarılar vardırmaliyet, tek bir transgenik fare ve germ DNA 10 rastgele transgen yerleştirme sözde kurucu efekti oluşturmak için zamanın uzunluğu. Bu nedenle, çok az sayıda TCR transjenik farenin herhangi bir antijen için oluşturulan ve aynı epitop için yüksek ve düşük TCR afinite fonksiyonel etkileri nadir ele alınmaktadır. Ekrana hızlı bir yaklaşım gereksinimi işaret etmektedir ve tek tek ya da kombinasyon halinde birden fazla TCRlerin incelemek için, (retrovirüs ile ilgili "geriye" ve transjenik 'gen') retrogenic farenin transgenik fareler 11-13 TCR'ye bir alternatif olarak kullanılmaktadır.
Birkaç virüs içinde bulunan 2A peptid ortak motif parçalanma 2A glisin ve 2B, prolin ile meydana geldiği, bir 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gli-2B-Pro oluşmaktadır cis -Oyunculuk hidrolaz aktivitesi ile ilgili, çeviri 10,14-16 boyunca ribozomal atlama sonuçlanır. c gösteren detaylı bir diyagram içinBu şekilde, tek bir vektörde stoikiometrik tercüme sonucu bağlanabilir 2 cistrons (TCR alfa ve TCR beta) 12. – çeşitli 2A peptidler (F2A, E2A, T2a, P2A) arasında leavage referans 10 bakınız. Bu anlayışla, biz ifade ve doğrudan in vivo çoklu antijen spesifik TCRler karşılaştırmak mümkün.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolde, optimal kemik iliği sağlık, transdüksiyon verimliliği ve sulandırma sağlamak için detay birkaç kritik adımlar biz. İlk kritik bir adım üretimi ve GP + E86 viral üretici hücrelerin uygun bakım olduğunu. erken geçiş üretici hücre çizgileri kullanın% 80 birleşme ya da daha düşük, kullanımdan önce en korumak. 48 saat – taze GP + E86 viral üretici hücreleri yaparken, 293T hücreleri erken geçiş ve 24 için kültüründe büyüyen sağlamak. transdüksiyon aşaması esnasında çok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma MLB, BCM'deki Diyabet Araştırma Merkezi (P30-DK079638) Pilot / Fizibilite Programı, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA NIH (5K22A1119151-01 ve 1R56DK104903-01) hibe ile desteklenmiştir 1-15-JF-07, İmmünoloji MB Bursu ve Robert ve Janice McNair Vakfı'nda AAI Kariyer.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
