فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
وقد قدرت الخلايا التائية مستقبلات (TCR) ذخيرة من البشر والفئران في 1 × 10 8 و 2 × 10 6 TCRs فريدة من نوعها على التوالي 1،2. هذا التنوع الكبير يسمح خلايا T إلى التعرف على مجموعة واسعة من الحواتم المستضد المستمدة من الببتيدات الذاتي وكذلك من مسببات الأمراض التي قدمها معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) على خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). الاختلافات الطفيفة في تفاعلات TCRs مع المجمعات الببتيد MHC فريدة من نوعها تملي ما إذا كانت الخلايا التائية سيخضع لموت الخلايا المبرمج، استعطال، التنشيط، والتمايز، وإنتاج السيتوكينات أو السمية الخلوية. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى مرجع TCR كبير، وتحليل كيف يمكن لTCR معينا سوف تستجيب لمستضد معين يتطلب استخدام أنظمة TCR واحدة.
وقد ولدت مختلف الفئران المعدلة وراثيا TCR من أجل دراسة وظيفة من TCR واحد في نموذج في الجسم الحي 3-9. ومع ذلك، هناك محاذير لTCR الفئران المعدلة وراثيا بما في ذلكالتكلفة، وطول الفترة الزمنية لتوليد الفئران المحورة جينيا واحد ويسمى تأثير مؤسس الإدراج التحوير عشوائي في الحمض النووي سلالة الجرثومية 10. لذلك، تم إنشاء عدد قليل نسبيا من الفئران المعدلة وراثيا TCR عن أي مستضد معين والآثار الفنية من ارتفاع وانخفاض تقارب TCR لنفس حاتمة نادرا ما يتم التصدي لها. لمعالجة الحاجة إلى نهج السريع إلى الشاشة ودراسة TCRs متعددة منفردة أو مجتمعة، وقد استخدمت الفئران retrogenic ( 'الرجعية' من الفيروس الارتجاعي و "جينك" من المعدلة وراثيا) كبديل لTCR الفئران المعدلة وراثيا 11-13.
و2A الببتيد إجماع عزر وجدت في غضون عدة الفيروسات تتكون من 2A-ASP-فال / إيل تخمة-X-الأسباراجين برو-الغليسين-2B-برو، الذي يحدث انشقاق بين الجلايسين من 2A والبرولين من 2B من رابطة الدول المستقلة -acting النشاط هيدرولاز، مما أدى إلى تخطي الريبوسومي خلال الترجمة 10،14-16. رسم تخطيطي مفصل تصور جleavage من مختلف الببتيدات 2A (F2A، E2A، T2A وP2A) يرجى الرجوع إلى المراجع 10 – 12. وبهذه الطريقة، 2 cistrons (TCR ألفا وبيتا TCR) يمكن أن تكون مرتبطة مما أدى إلى ترجمة متكافئة في ناقل واحد. باستخدام هذا النهج، ونحن قادرون على التعبير عن ومقارنة مباشرة متعددة TCRs محددة مستضد في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول، ونحن بالتفصيل عدة خطوات حاسمة لضمان الأمثل الصحة نخاع العظم، وكفاءة ترنسدوكأيشن وإعادة. الخطوة الأولى الحاسمة هي جيل والصيانة الصحيحة للخلايا المنتجة الفيروسي GP + E86. استخدام ممر خطوط الخلايا المنتجة المبكرة والاحتفاظ بنسبة 80٪ confluency أو أقل قبل استخدا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5K22A1119151-01 و1R56DK104903-01) لملب، البرنامج التجريبي / الجدوى من مركز أبحاث مرض السكري (P30-DK079638) في BCM، JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF، ADA وظائف المعهد العربي الأميركي في علم المناعة زمالة لMB، ووروبرت ومؤسسة جانيس ماكنير 1-15-JF-07.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
