Summary

의 내부 기관 관리<em> 헤모필루스 인플루엔자</em> 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Published: March 02, 2016
doi:

Summary

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Abstract

여기, 우리는 효율적으로 자세한 절차를 설명하고 직접 헤모필루스 인플루엔자를 제공 마우스의 하부 호흡기로. 우리는 H. 제조 과정을 보여 인플루엔자 접종, H.의 내부 기관 점안 폐에 인플루엔자, 차동 유전자 발현 분석을위한 기관지 폐포 세척액 (BALF), 폐포 세척액에서 면역 세포의 분석 및 RNA 분리의 컬렉션입니다. 이 절차는 임의의 박테리아, 바이러스 또는 진균에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 적은 모호성으로보다 효율적으로 하부 호흡기로 세균 접종을 제공하기 때문에 직접 기관 점안은 주로 비강 내 또는 에어로졸 흡입 절차를 통해 바람직하다.

Introduction

염증은 감염 인자에 대한 방어의 기본 면역 메커니즘입니다. 그것은 병원균 퇴치 및 손상된 조직의 복구를 촉진한다. 또한, 일반 건강 상태 1로 회복을 용이하게한다. 그러나, 조절 이상 염증은 종종 만성 염증성 질환이 리드. 기도 염증은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 및 폐 섬유증과 같은 3 가지 폐 질환의 초기 트리거이다.

비 typeable (봉입) 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)의 상부 및 하부 만성 폐 염증성 질환 4,5-와 연관된다. 그것은 만성 폐쇄성 폐 질환 4,6,7 어린이와 성인의 하부기도에서 분리 지배적 인 종이다. NTHi 감염 후 염증 반응은 (예컨대 TNF 및 IL-1β와 같은) 염증성 사이토킨의 상향 조절이 특징이며, B를 매개y를 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 수신자와 같은 수용체를 통해 핵 인자 κB (NF-κB) (TLR에) 8.

마우스 모델 때문에 서로 다른 유전자가 결핍 된 라인의 가용성의 폐 염증성 질환의 기본 병리학을 분석하는 매우 유용한 도구입니다. 여러 방법은 비내 점적 및 에어로졸 흡입 9,10- 포함한 실시간 / 감쇠 박테리아와 세균 제품을 접종하는데 사용되었다. 여기, 우리는 내 기관 점안을 보여줍니다. 덜 빈번하게 사용되지만,이 방법은 더욱 효율적이고 때문에 하부 호흡기 접종원 직접 전달 재현성이다.

Protocol

모든 실험은 베일러 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다. 1. 배양 비 typeable 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)과 접종 준비 초콜릿 한천 플레이트 접시 NTHi를 37 ° C, 5 % CO 2에서 하룻밤 가습 CO 2 배양기에서 거꾸로 판을 유지한다. 다음 날, 문화 뇌 심장 주입 국물에 박테리아. 그런 다음, 멸균 1.5 ML 튜브로 국물 1 ?…

Representative Results

내 기관 점안은 식염수 설치보다 폐포 세척액 (그림 1A, 왼쪽 패널)에서 백혈구의 현저하게 증가 된 수의 결과. 백혈구의 미분 계수 분석 분명히 증가 호중구 침윤 (도 1, 오른쪽 패널)을 보였다. BALF에서 세포의 FACS 분석은 상기 호중구 수의 증가 (도 1b)를 확인했다. 폐 조직을 H & E 염색 섹션의 조직 학적 분석은기도 염증 (도 1C)…

Discussion

여기서, 우리는 박테리아 폐 병원체와 마우스의 폐를 접종 독특하고 최소 침습 절차를 설명합니다. 우리는이 절차 염증성 신호 전달 경로의 유전자 결핍 마우스를 이용하여 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 바이러스 및 진균 감염에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 이러한 비내 에어로졸 또는 흡입 같은 다른 방법을 통해이 절차의 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

Materials

Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

References

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

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Cite This Article
Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

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