Summary

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d'un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d'accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état ​​différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu'ils atteignent la spécialisation terminale mature, ils conservent de manière stable , il 1.

Dans les dernières années , un certain nombre de protocoles ont été développés, qui permettent la reprogrammation de la pluripotence d'une cellule somatique (iPS) obtenue par l'expression forcée d'un ensemble de facteurs de transcription 2,3. Alternativement, la conversion de cellules peut être obtenue par transdifférenciation lignée directe, l' introduction d' un seul 4 </sup> ou une combinaison de facteurs de transcription 5-7. Cette stratégie ne concerne pas le passage par un état ​​de différenciée mais nécessite une forte expression de facteurs de transcription spécifiques 8.

Nous avons récemment développé un protocole de conversion basé sur la brève exposition des cellules adultes aux propriétés de déméthylation de la cytidine analogique 5-azacytidine (5-aza-CR), un inhibiteur de l'ADN méthyltransférase bien caractérisé. L'étape de déméthylation est immédiatement suivie par un protocole de différenciation spécifique 11/09 qui permet d'obtenir le phénotype de terminal requis. Ce procédé est capable de transformer des cellules matures différenciées en cellules d'une lignée différente et présente l'avantage considérable d'éviter à la fois l'utilisation de vecteurs viraux et la transfection de facteurs de transcription exogènes. L'acquisition d'un état pluripotent stable, et une sensibilité accrue liée à la cellule d'instabilité est également évitée.

<p class="Jove_content"> Le protocole détaillé qui permet la conversion des fibroblastes adultes de peau humaine en cellules sécrétrices d'insuline entièrement fonctionnel est présenté ici. Toutefois, il convient de noter que la technique a été appliquée à différents types de cellules et a donné des résultats positifs, lorsque les cellules d'adressage vers différentes voies de différenciation. En outre, la conversion épigénétique a été utilisé avec succès dans l'espèce humaine et porcine 9-13, ainsi que chez le chien (manuscrit soumis) , suggérant une grande efficacité et la robustesse de l'approche.

Protocol

Remarque: Toutes les procédures décrites ci-après doivent être effectuées sous hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Assurez-vous que toutes les procédures de culture sont effectués sur les stades thermostatiques et les cellules sont maintenues à 37 ° C tout au long de leur traitement. 1. Peau Fibroblast Isolation Préparer Culture Solution Dish Coating Dissoudre 0,1 g de gélatine de porc dans 100 ml d'eau (concentration finale 0,1%). Stériliser solution avec a…

Representative Results

Mise en place de la culture primaire à partir de biopsies de peau Des biopsies cutanées ont été découpées en petits morceaux et placés dans des boîtes pré-revêtues de gélatine. Au bout de 6 jours, les fibroblastes commencent à croître à partir de fragments de tissus et ont formé une monocouche de cellules (figure 1A). Les cellules ont montré une forme typique allongée et, comme prévu, affichent une immuno-positivité uniforme pour le fibroblaste …

Discussion

La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d'insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d'un protocole d'induction spécifique d'un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l' endoderme liées, sans l'expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l'acquisition d'un état ​​pluripotent stable, qui rend les cell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD). GP est soutenu par une bourse post-doc de l'Université de Milan. Les auteurs sont membres de l'Action COST FA1201 Epiconcept: Epigénétique et périconceptionnelle environnement et l'action COST partage BM1308 avance sur les grands modèles animaux (SALAAM). TALB est membre du COST Action CM1406 épigénétique Chemical Biology (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

References

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Cite This Article
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

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