Summary

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Een fundamentele doelstelling van de regeneratieve geneeskunde is het genereren van nieuwe, functionele cellen die kunnen worden gebruikt voor het repareren of vervangen van beschadigde, ontaardde weefsels. Herbouwen gemakkelijk beschikbaar volwassen cellen in nieuwe, door ze te converteren van de ene cel naar het andere, is een bijzonder aantrekkelijke benadering, vooral wanneer de gewenste celpopulatie niet overvloedig of moeilijk toegankelijk. Echter, volwassen cellen opmerkelijk stabiel. Zij krijgen hun gedifferentieerde toestand via een geleidelijke beperking van hun mogelijkheden en, als ze eenmaal de volwassen terminal specialisatie te bereiken, ze stabiel te houden dat 1.

In de afgelopen jaren een aantal protocollen ontwikkeld, dat de herprogrammering mogelijk om pluripotentie van een somatische cel (iPS) gerealiseerd door geforceerde expressie van een aantal transcriptiefactoren 2,3. Als alternatief kan de cel conversie worden verkregen door directe afstamming transdifferentiatie, de invoering van een enkele 4 </sup> of een combinatie van transcriptiefactoren 5-7. Deze strategie is niet de overgang door middel van een-de gedifferentieerde toestand te betrekken, maar vereist een hoge expressie van het specifieke transcriptiefactoren 8.

We hebben onlangs een conversie protocol gebaseerd op de korte blootstelling van volwassen cellen aan de demethylerende eigenschappen van het cytidine analoog 5-azacytidine (5-aza-CR), een goed gekarakteriseerde DNA-methyltransferase inhibitor. De demethylering stap wordt onmiddellijk gevolgd door een differentiatie protocol 9-11 waarmee de vereiste terminal fenotype te verkrijgen. Deze methode kan rijpe, gedifferentieerde cellen omgezet in cellen van een ander geslacht en heeft aanzienlijke voordelen voor zowel het gebruik van virale vectoren en transfectie van elke exogene transcriptiefactoren voorkomen. De overname van een stabiele pluripotente toestand, en de daarmee samenhangende verhoogde gevoeligheid voor instabiliteit cel wordt ook vermeden.

<p class="Jove_content"> De gedetailleerde protocol dat de omzetting van volwassen menselijke huid fibroblasten in volledig functionele insuline uitscheidende cellen te bestuderen wordt hier gepresenteerd. Het is echter opgemerkt dat de techniek toegepast op verschillende celtypes en positieve resultaten heeft gegenereerd, bij het adresseren cellen aan verschillende differentiatieomzettingswegen. Bovendien is epigenetische omzetting met succes gebruikt in de humane en varkens 9-13 en bij honden (manuscript ingediend) suggereert een grote effectiviteit en robuustheid van de benadering.

Protocol

Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle cultuur procedures worden uitgevoerd op thermostaatkraan podia bij 37 ° C gedurende hun behandeling uitgevoerd en cellen worden gehandhaafd. 1. Skin Fibroblast Isolation Bereid Cultuur Dish Coating Solution Los 0,1 g varkensgelatine in 100 ml water (eindconcentratie 0,1%). Steriliseren oplossing met een autoclaaf. Voeg 1,5 ml ster…

Representative Results

Oprichting van primaire kweek van de huid biopsieën Skin biopsies werden in kleine stukken gesneden en in gelatine vooraf beklede schalen. Na 6 dagen, fibroblasten gaan groeien uit het weefsel fragmenten en vormden een monolaag van cellen (Figuur 1A). Cellen vertoonden typische langwerpige vorm en, zoals verwacht, vertoonden een uniforme immuun-positiviteit voor fibroblast specifieke marker vimentine (Vim, figuur 1B). <p class="jove_content" …

Discussion

Dit manuscript beschrijft een werkwijze die de omzetting van menselijke huidfibroblasten in insulineproducerende cellen toestaat, door een voorbijgaande en korte blootstelling aan 5-aza-CR, gevolgd door een weefselspecifieke inductieprotocol. Deze benadering maakt een overstap van mesoderm naar endoderm gerelateerde cellen, zonder dat de geforceerde expressie van transcriptiefactoren of microRNAs, noch de verwerving van een stabiele pluripotente toestand, dat cellen meer instabiel en gevoelig voor fouten 14 m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en de Europese Stichting voor de Studie van Diabetes (EFSD). GP wordt ondersteund door een post-doc fellowship van de Universiteit van Milaan. De auteurs zijn lid van de COST Actie FA1201 Epiconcept: Epigenetica en Periconception omgeving en de COST Actie BM1308 Sharing voorschotten op grote diermodellen (SALAAM). TALB is lid van de COST Actie CM1406 Epigenetische Chemical Biology (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

References

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Play Video

Cite This Article
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

View Video