Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
연령 관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서 시각 장애의 주요 원인이다. 질병은 중심 시력의 손실의 결과, 망막 황반의 호출 센터의 파괴로 드러난다. 초기 AMD는 지리적 위축 (AMD 건조) 또는 혈관 신생 (젖은 AMD)으로 늦은 AMD에 진행 할 수 있습니다 부드러운 드루 젠이라는 작은, 황색 병변의 존재에 의해 특징입니다. 임상 적 변화가 잘 설명하고 있으며, AMD의 위험을 부여에 유전 적 영향에 대한 이해가 더욱 상세한지고 있지만, 주요 진행 상황을 결여 한 영역은 유전 적 위험의 생화학 적 결과에 대한 이해이다. 이것은 부르크 막, 혈액 공급으로부터 물질의 생물학적 필터 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층이있는 지지체 역할을 매우 얇은 세포 외 기질의 생화학을 이해하는데 어려움을 부분적으로 기인한다. 드루 젠 F브루흐의 막과 자신의 존재 내에서 ORM은 망막 색소 상피 세포에 영양분의 흐름을 방해. 만 다른 단백질이 상호 작용하는 방식 참으로 브루흐의 막 단백질 성분을 조사,에 의해, 연구진은 드루 젠 형성, 개발 AMD의 이후 시력 상실을 뒷받침 생화학 적 메커니즘을 해명 희망 할 수 있습니다. 이 문서는 하류 생화학 적 분석에 사용, 이것은 이미 부르크 막 생화학의 이해를 변경하는 방법의 예를 제공 할 수 있도록, 전체 브루흐의 막, 또는 단지 황반 영역에서 하나를 풍부하게하기위한 방법을 자세히 설명합니다.
안과 연구의 사후 부검 인간의 눈 조직의 사용은 안과 질환의 발병 기전의 이해를위한 귀중한 자원이다. 인간의 기증자 눈의 분석은 서구 세계 1 실명의 주요 원인 인 노인성 황반변 성 (AMD)을 뒷받침하는 메커니즘을 분별하는 중요한 기여를했다. 전 세계적으로, AMD는 모든 실명의 약 8.7 %를 차지하고과 점점 고령화와 함께, 그것은 중심 시력의 손실에서 2020 2. AMD 결과에 의해 196,000,000명에 영향을 미칠 것으로 예상되고, 환자의 독립성과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다 3. 초기 AMD 드루 젠이 형성되는 것을 특징으로하며 (또한, 혈관 신생 또는 "습식"AMD 라 함) (때로는 "건식"AMD 라 함) 지리적 위축, 또는 황반변 성으로 진행할 수있다. 안티 VEGF 동안 주사는 안정하거나 신생 혈관 AMD의 IT 내가 시력을 향상치료가 아니다, 그리고 현재 어떤 치료는 지리적 위축에 대한 존재하지 않습니다.
특정 유전자 변이가 AMD의 위험 4 수정하는 것으로 나타났다 동안 – 8, 이하 이러한 변형은 생화학 적 수준에서 황반에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 알려져있다. AMD의 발병 기전에 중요한 사이트는 브루흐의 막이다. 이 구조와 다양한 연구 내에서 드루 젠 형태와 AMD 9 부르크 막 주위 보체 활성화의 증거를 제공했다. 부르크 막 맥락막으로부터 망막 색소 상피 세포를 분리하는 세포 외 기질의 시이트이고, 약 4 ㎛의 두께이다. 부르크 막 맥락막 모세로 병합 유창 모세 혈관이 외부를 포함 맥락막의 층은 큰 혈관 (10) (도 1a)을 함유하는 층이다.
브루흐의 멤브레인은 별도의 pentilaminar 시트입니다세포 기질 (ECM), 그리고이 방법은 적혈구와 크게 decellularized 무료 인 (이하, 부르크 막 농후 함)의 기본 맥락막 모세 ECM과 함께, 부르크 막 분리 방법 자세히. 농축 부르크 막 후 웨스턴 블 롯팅 및 조직학 실험에 사용 하였다. 또한, 눈의 황반 지역에서 유일하게 브루흐의 멤브레인을 풍부하게하기위한 방법이 설명되어 있습니다, AMD의 생화학 적 측면을 조사하는 사람들에게 특히 관심이 될 것이다.
여기에서 우리는 추가 분석이 서양 블롯 (11), 질량 분석 및 활용 수정 챔버 11,14 Ussing 브루흐의 멤브레인의 확산 특성을 포함한 이후의 분석을 허용하는 브루흐의 멤브레인의 농축에 대해 설명합니다. 중요한 단계는) 눈의 내면의 철저한 긁고 세탁 부르크가 붕괴를 발생시키지 않고 모든 RPE 세포 b) 하부 맥락막의 반복 및 조심 긁어 제거하고, 초순수에서 적출 부르크의 c) 세척 포함 잔여 세포의 용해를 확인합니다. 농축 부르크 막 단백질체 분석에 이용 될 것인지 또한, 우레아 처리하여 단백질을 추출 기계적 균질화 같은 다른 방법에 비하여 탄성이 조직을 분해에 가장 효과적이다. 풍부한 부르크 막의 조직학은 맥락막 모세의 ECM이 제거되지 않음을 나타냅니다. 이 전 할 것입니다pentilaminar 부르크 막의 외층은 예견했던 맥락막 모세 내피 세포의 기저막에 의해 형성된다. 실제로는 변화가 터미널 보완 복잡한 / 막 공격 복합체 (MAC) (15)의 증착을 포함한 AMD이에서 발생하는 맥락막 모세의 ECM이 남아 유리할 수있다. 그것은 공막, 맥락막, 및 부르크 막의 존재 단면 경우 부르크 막 상세한 조직 학적 분석을 위해, 그것의 구조가 잘 보존 될 것이라는 점에 유의해야한다. 실제로,도 2에 제시된 조직학는 전적으로이 원고에 기재된 기술로부터 얻어진 농축의 정도를 설명하기위한 것이다.
황반 부르크의 농축은 NSR 특히 황반이 손상되지 않도록 보장, 아이 컵의주의 절개가 필요합니다; 그렇지 않으면 식별 및 황반의 이렇게 분리가 불가능합니다. tissu의 무결성전자는이 과정에 중요하며 따라서 48 시간 사후 시간에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 농축 정도는 도너 사이에서 변화하고 도너 연령, 사후 시간, 및 안구 병변의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 농축 된 용어의 사용은이 '정제'또는이 방법을 사용 부르크 막 '차단'은 단순히 불가능하다고되고, 기술의 한계를 인정할 의도적이다. 실제로, 맥락막 모세의 ECM은 브루흐의 막으로 병합 주어진 것은이 완전한 분리는 가능하지 않습니다.
각각의 안구 조직의 생화학 적 변화를 이해하는 것은 눈 질병의 진행을 이해하는데 필수적이다. 브루흐의 멤브레인의 독특한 농축이 이해를 용이하게; 진행중인 연구는 AMD의 다른 단계에서 질량 분석법을 이용하여 농축 된 황반 부르크 막 프로테옴을 조사다른 유전자형을 가진 환자에서 발생하는 샘플에서 AMD의 분자 병리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 이미 기술 된 기법을 성공적으로 농축 부르크 막에 부르크 막 (11) 및 추가 연구의 주된 보체 조절 제로 FHL-1을 식별하는 데 사용 된 AMD의 분자 병리에 더 많은 새로운 통찰력을 초래할 가능성이있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 박사 이삭 잠브라노와 인간의 기증자의 안구 조직의 공급에 대한 맨체스터 안과 병원 안구 은행의 직원, H & E 염색 이미지 생명 과학 조직학 시설의 학부 씨 피트 워커를 인정하고 싶습니다. 특별 감사는 현미경으로 그의 도움 씨 로저 메도우로 이동합니다. SJC는 의료 연구위원회의 수신자 (MRC) 경력 개발 원정대 (MR / K024418 / 1)이고 저자는 또한, MRC (G0900538 및 K004441)에서 다른 최근의 연구 자금을 인정 시력 (1866)과 황반 사회를위한 싸움.
Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
(A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
(B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
(C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |