Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di disabilità visiva nel mondo sviluppato. La malattia si manifesta con la distruzione del centro della retina, chiamata macula, con conseguente perdita della visione centrale. All'inizio AMD è caratterizzato dalla presenza di piccole lesioni giallastri chiamati drusen morbido che può progredire sul ritardo AMD come atrofia geografica (asciugare AMD) o neovascolarizzazione (AMD bagnato). Anche se i cambiamenti clinici sono ben descritti, e la comprensione delle influenze genetiche sul conferimento rischio AMD stanno diventando sempre più dettagliata, un settore privo di importanti progressi è la comprensione delle conseguenze biochimiche di rischio genetico. Ciò è dovuto alla difficoltà di comprendere la biochimica della membrana di Bruch, una matrice extracellulare molto sottile che agisce come un filtro biologico di materiale dalla fornitura di sangue e un'impalcatura su cui risiede la retina epiteliali del pigmento (RPE) monostrato cellulare. Drusen form all'interno membrana di Bruch e la loro presenza interrompe il flusso di sostanze nutritive alle cellule RPE. Solo studiando la composizione proteica della membrana di Bruch, e infatti come altre proteine interagiscono con esso, possono ricercatori sperano di svelare i meccanismi biochimici alla base formazione drusen, sviluppo di AMD e la conseguente perdita della vista. Dettagli Questo documento metodologie per arricchire o membrana di Bruch intero, o solo dalla regione macula, in modo che possa essere utilizzato per l'analisi biochimica valle, e forniscono esempi di come questo sta già cambiando la comprensione della membrana biochimica del Bruch.
L'uso di post mortem tessuto oculare umano nella ricerca oftalmica è una risorsa inestimabile per la comprensione della patogenesi della malattia degli occhi. Analisi di occhi donatori umani è dato un contributo importante a discernere i meccanismi alla base età degenerazione maculare (AMD), che è la principale causa di cecità nel mondo occidentale 1. A livello globale, AMD rappresenta circa l'8,7% dei casi di cecità e con un crescente invecchiamento della popolazione, si prevede che interessare 196 milioni di persone entro i risultati 2020 2. AMD nella perdita della visione centrale e ha un impatto profondo sulla indipendenza e la qualità della vita dei pazienti 3. Presto AMD è caratterizzata dalla formazione di drusen e può progredire ad atrofia geografica (a volte indicato come 'a secco' AMD), o neovascolarizzazione coroidale (noto anche come neovascolare o 'bagnato' AMD). Mentre anti-VEGF iniezioni possono stabilizzare o migliorare la visione in AMD neovascolare che iNon è curativo, e allo stato attuale, non esiste un trattamento per l'atrofia geografica.
Mentre alcune varianti genetiche hanno dimostrato di modificare AMD rischio 4-8, meno si sa su come queste varianti influenzano la macula a livello biochimico. Un sito importante nella patogenesi di AMD è membrana di Bruch. Modulo Drusen all'interno di questa struttura e diversi studi hanno fornito la prova di attivazione del complemento in ed intorno a membrana di Bruch in AMD 9. Membrana di Bruch è un foglio di matrice extracellulare che separa le cellule della retina epiteliali del pigmento (RPE) dalla coroide, ed è di circa 4 micron di spessore. Membrana di Bruch fonde le coriocapillare, uno strato della coroide che contiene capillari finestrate ed esterni a questo sono strati contenenti vasi sanguigni più grandi 10 (Figura 1A).
Membrana di Bruch è un foglio di pentilaminar supplementarematrice cellulare (ECM), e questa metodologia dettagli come isolare membrana di Bruch, insieme con la ECM delle choriocapillaris sottostanti (di seguito arricchito membrana di Bruch), che è in gran parte decellularized e privo di globuli rossi. Arricchita membrana di Bruch è stato poi utilizzato per asciugare e istologici esperimenti occidentali. Inoltre, la metodologia per arricchire membrana di Bruch esclusivamente dalla regione macula dell'occhio è descritto, che saranno di particolare interesse per coloro indagare gli aspetti biochimici della AMD.
Qui si descrive l'arricchimento della membrana di Bruch per ulteriori analisi che consente analisi successive tra cui western blotting 11, spettrometria di massa e le proprietà di diffusione della membrana di Bruch utilizzando modificata Ussing camere di 11,14. Passaggi critici comprendono a) la raschiatura accurata e lavaggio della superficie interna dell'occhio per rimuovere tutte le cellule RPE b) la raschiatura ripetuta e accurata della coroide sottostante senza causare del Bruch a disintegrarsi e c) lavaggio della Bruch asportato del in acqua ultrapura per assicurare la lisi delle cellule residue. Inoltre, se la membrana di Bruch arricchito deve essere utilizzato per l'analisi proteomica, estrazione di proteine mediante trattamento urea è il più efficace per abbattere questo tessuto resistente rispetto ad altri metodi quali l'omogeneizzazione meccanica. Istologia di membrana arricchito di Bruch indica l'ECM del coriocapillare non viene rimosso. Questo deve essere expected come lo strato esterno della membrana di Bruch della pentilaminar è formato da choriocapillaris endoteliali membrane basali cellule. Infatti può essere vantaggioso che il ECM del choriocapillaris rimane come eseguite modifiche in questo AMD inclusa la deposizione di complesso complesso / attacco alla membrana complemento terminale (MAC) 15. Va notato che per dettagliata analisi istologica della membrana di Bruch, la sua struttura sarebbe meglio preservata se sezionato in presenza di sclera, coroide, e la membrana di Bruch. Infatti, l'istologia illustrato nella figura 2 è destinato esclusivamente per dimostrare il grado di arricchimento derivante dalla tecnica descritta in questo manoscritto.
Arricchimento di maculare Bruch di richiede un'attenta dissezione del oculare, assicurando che la NSR e in particolare la fovea non siano danneggiati; altrimenti constatazione e pertanto l'isolamento della macula non sono possibili. L'integrità del tissuE 'anche importante a questo processo e si raccomanda pertanto di utilizzare campioni in 48 ore di tempo post mortem. Il grado di arricchimento richiesto varia fra i donatori e può essere influenzata dall'età del donatore, tempo di post-mortem, e la presenza di eventuali patologie dell'occhio. L'uso del termine arricchito è intenzionale nel riconoscere una limitazione della tecnica, questo è che 'purificazione' o 'isolamento' della membrana di Bruch con questo metodo semplicemente non è possibile. Infatti, dato che l'ECM del coriocapillare si fonde in membrana di Bruch ci completa separazione non è fattibile.
Comprendere i cambiamenti biochimici dei rispettivi tessuti oculari è essenziale per comprendere la progressione della malattia degli occhi. Questo arricchimento unica della membrana di Bruch facilitare questa comprensione; studi in corso stanno studiando il proteoma di maculare arricchito membrana di Bruch con la spettrometria di massa in diverse fasi di AMDe in campioni provenienti da soggetti con diversi genotipi di migliorare la comprensione della patologia molecolare di AMD. Già la tecnica qui descritta è stata utilizzata per identificare con successo FHL-1 come regolatore complemento predominante nella membrana 11 e ulteriori studi di Bruch sulla membrana arricchito di Bruch sono suscettibili di tradursi in ulteriori nuove intuizioni della patologia molecolare del AMD.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Isaac Zambrano e il personale della Eye Hospital Banca degli Occhi di Manchester per la fornitura di tessuti dell'occhio donatore umano, e il signor Pete Walker della Facoltà di Scienze della Vita Istologia impianto per le immagini H & E macchiato. Un ringraziamento speciale va a Roger Meadows per il suo aiuto con il microscopio. SJC è destinatario di un Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1) e gli autori anche riconoscere altre recenti finanziamenti alla ricerca da MRC (G0900538 e K004441), Lotta per Sight (1866) e The maculare Society.
Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
(A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
(B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
(C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |