Summary

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Published: December 24, 2015
doi:

Summary

Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.

Abstract

La inmunidad adaptativa está regulado por las interacciones dinámicas entre las células T y las células presentadoras de antígeno ("APC") refiere como 'sinapsis inmunológicas. Dentro de estas interfaces de célula-célula íntimos grupos subcelulares discretos de MHC / Ag-TCR, F-actina, adhesión y moléculas de señalización forman y remodelar rápidamente. Estas dinámicas se cree que son determinantes críticos de la eficiencia y la calidad de las respuestas inmunes que se desarrollan y, por tanto, de protección contra la inmunidad patológica. El conocimiento actual de las sinapsis inmunológicas con fisiológica APC está limitada por la insuficiencia de la resolución de las imágenes se puede obtener. Aunque los modelos de sustratos artificiales (por ejemplo, bicapas lipídicas planas) ofrecen una excelente resolución y han sido herramientas muy valiosas, que son inherentemente no fisiológica y simplificada. Las células endoteliales vasculares y linfáticos se han convertido en un importante tejido periférico (o estroma) Compartimiento de "semi-profesionalal APC '. Estas APCs (que expresan la mayor parte de la maquinaria molecular de APCs profesional) tienen la característica única de la formación de la superficie celular prácticamente planar y están fácilmente transfectable (por ejemplo, con los reporteros fluorescentes de proteínas). Aquí un enfoque básico para implementar las células endoteliales como una novela y fisiológica 'planar modelo APC celular' para mejorar la formación de imágenes y el interrogatorio de los procesos de señalización antigénicos fundamentales se describirá.

Introduction

Los linfocitos T son una rama del sistema inmune adaptativo que se caracteriza por la capacidad de reconocer eficientemente péptido antígeno (Ag) unida a complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) moléculas a través de sus receptores de células T (TCR) 1. Linfocitos ingenuos constitutivamente migran y escanear 'Ag células presentadoras profesionales' (APC; por ejemplo, células dendríticas) en los ganglios linfáticos, mientras que las células de memoria / T efectoras necesitan para estudiar con eficacia una muy amplia gama de vehículos blindados y potenciales células diana dentro de los tejidos periféricos.

En el min tras el reconocimiento inicial de cognado Ag en un APC, linfocitos detener su migración y comienzan a formar una interfaz célula-célula íntima especializado denominado 'sinapsis inmunológica "(IS). Sostenida (es decir, 30 a 60 min) ES se requieren contactos para ampliar y mantener la señalización 2-7. Estudios emergentes identificar que dentro del IS, que es la formación continua y rápida remodeling de señalización subcelular micro-grupos discretos (es decir, que contienen MHC / Ag-TCR, F-actina, la adhesión y moléculas de señalización) que determinan la fuerza y la calidad de la que resulta la respuesta inmune 2-7. Sin embargo, los detalles dinámicos y mecanismo de regulación de este proceso se conocen por completo 8,9. Esto se debe en gran parte de los desafíos técnicos asociados con topologías irregulares de las superficies de APC y la orientación de un mal control de los planos de interacción célula-célula, las cuestiones que limitan profundamente la imagen espacio-temporal necesaria acerca 10.08 (Figure1A).

Figura 1

Figura 1. Un fisiológica planar Modelo APC Cell for Imaging inmunológica Synapse Dynamics. El esquema ilustra la imagen tradicional de la sinapsis inmunológica entre una célula T y un professio nal de células APC (A) y T y un modelo tradicional de lípidos planar APC bicapa (B) en comparación con este novedoso modelo de APC planar endotelial (C). APCs profesionales proporcionan sinapsis inmunológicas fisiológicas pero ofrecen interfaz mal orientada célula-célula (es decir, con respecto al plano óptima de imagen xy; resolución ~ 0,2 micras), lo que compromete drásticamente espacial (z plano de la imagen de resolución ~ 1 m) y temporal (es decir, debido a la necesidad de escanear repetidamente a través de todos los planos de formación de imágenes z) resolución de la imagen. Modelos bicapa tienen una topología plana que ofrece óptima de imágenes de resolución espacio-temporal, pero también son muy simplificada, no fisiológico y rígido. Este modelo de células endoteliales combina la topología planar de bicapas lipídicas con el sustrato fisiológico de un APC clásico para entregar óptima de imágenes de resolución espacial y temporal en un entorno fisiológico.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El trabajo previo ha eludido parcialmente estos obstáculos mediante el desarrollo de modelos sustrato plano (es decir, bicapas lipídicas y las superficies recubiertas de anticuerpo) que proporcionan resolución espacio-temporal óptima (es decir, a través de la fijación de la superficie de activación de las células T en un único plan que es paralela a la proyección de imagen óptima xy avión) 11 a 15 (Figura 1B). Estos modelos han facilitado importantes conocimientos sobre la dinámica subcelulares / moleculares que controlan la señalización antigénico en las células T, incluyendo el descubrimiento de actina dinámica / TCR señalización micro-clusters 7,11-14. Sin embargo, tales modelos están inherentemente simplificaron, así como rígido (que impide el desarrollo / estudio de características topológicas 3 dimensiones) (Figura 1B). Por lo tanto, sigue siendo incierto cómo relacionar estos hallazgos a physiologic célula-célula vigilancia inmune.

Aunque todavía poco estudiado, vascular y las células endoteliales linfáticas están emergiendo como un grande (es decir, mayor en número que todos los vehículos blindados profesionales, por ~ 1000 veces) compartimento periférico de "semi-profesional" APC 16-18. Estas células expresan MHC-I, MHC-II- y una multitud de moléculas co-estimuladoras (por ejemplo, CD40, LFA3, ICOSL, el 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; pero no CD80 y CD86) y son estratégicamente posicionado en la interfase sangre-tejido donde sirven funciones especializadas centinela 16-18. Estudios previos demostraron que las células endoteliales pueden efectivamente re-estimular efectoras / memoria, pero no ingenuo, las células T 19-25. Así, las células endoteliales es probable que desempeñen un papel único de APC en la fase efectora de la respuesta inmune adaptativa dentro de los tejidos periféricos, tales como la influencia local sobre la activación de células T, la diferenciación, la memoria y la tolerancia 16-17,26. Cricamente, cuando se cultivan in vitro, las células endoteliales forman superficies celulares prácticamente planas y están fácilmente transfectable (por ejemplo, con los reporteros fluorescentes de proteínas). Estas características son ideales para imágenes de alta resolución espacio-temporal de la dinámica topológicos durante las interacciones célula-célula 19,27. Por lo tanto las células endoteliales podrían servir como un 'celular plana APC modelo fisiológica claramente adecuado para el estudio de los mecanismos de remodelación subcelulares / molecular que impulsan el reconocimiento de antígenos y regulan las respuestas (Figura 1C) 19,20.

Previamente establecidos técnicas de imagen complementarios (incluyendo la transfección de las células endoteliales con los fabricantes de proteínas fluorescentes de la membrana plasmática y citosol) para estudiar los detalles de la interacción de leucocitos endotelial durante la adhesión y migración transendotelial 27, mostraron que los leucocitos sondean activamente la superficie del endotelio por Dynamic una inserciónd retracción de la sub-escala micrométrica, protuberancias cilíndricas de actina-ricos (~ 200-1.000 nm de diámetro y profundidad) denomina-invadosome como salientes (es decir, 'ILPS') 27,28. Estos enfoques de imagen se han ampliado aún más, junto con la creación de protocolos para tomar ventaja de la función endotelial de APC para desarrollar los primeros métodos de alta resolución de imagen espacio-temporal de la célula endotelial sinapsis inmunológica T según lo informado 19,20 y describir con más detalle en el presente documento. Un hallazgo central derivado de esta novela plana celular modelo de APC es que programas de vida independiente de células T funcionan tanto en la promoción de la detección inicial Ag y en el mantenimiento de la señalización posterior. De hecho, las matrices de múltiples programas de vida independiente (que fueron estabilizados y devengados en respuesta a sus iniciales en el flujo de calcio) muestran un enriquecimiento en TCR y moléculas sugestivos de señalización activa tal PKC-Q, ZAP-70, fosfotirosina y HS1. Por lo tanto, programas de vida independiente parecen representar un equivalente fisiológico tridimensional a la micro TCR de señalizaciónracimos visto en los modelos de dos capas planas. Este enfoque, por lo tanto, revela sensibilidad / informes dinámica molecular y arquitectónicos (y biomecánico implícitas) de otro modo no detectable.

El método descrito en este documento deberá ser útil para reducir la brecha entre los modelos de sustratos artificiales APC APC profesional y con el fin de mejorar nuestra capacidad de interrogar a los mecanismos básicos de la respuesta inmune adaptativa. Mientras que aquí la atención se centra en la activación de tipo Th1 CD4 + efectoras / célula de memoria, este enfoque básico puede ser modificado fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células T y Ags, como se discute a continuación.

Protocol

Todos los experimentos descritos en este protocolo se llevan a cabo con las células T humanas primarias y células endoteliales disponibles comercialmente primarios humanos (dérmica o microvascular pulmonar EC) protocolo de investigación Cualquie en seres humanos debe ser aprobada por una junta de revisión institucional y el consentimiento informado por escrito se debe proporcionar de cada donante de sangre. Los experimentos llevados a cabo usando este protocolo fue aprobado por el IRB de Beth Israel Deaconess Medical Center. <p cla…

Representative Results

Un enfoque de formación de imágenes novedoso utilizando células endoteliales y la combinación de las ventajas resolución de la planar bicapas lipídicas modelo con la complejidad fisiológica y la deformabilidad de las APC profesional fue desarrollado (Figura 1). La Figura 2 proporciona ejemplos de migración típica, el flujo de calcio y la dinámica topológicos observado con esta enfoque. En ausencia de la SAG en el endotelio, los linfocitos SAG-…

Discussion

En general, este protocolo describe métodos para la investigación de las células endoteliales como i) APC fisiológicos poco estudiada y ii) como un nuevo tipo de "modelo APC celular plana '. Con respecto a lo primero, se ha vuelto cada vez más apreciada que la APC periférica no hematopoyéticas (o 'estroma') juegan un papel crítico, no redundantes (es decir, en comparación con hematopoyético APC) en la conformación de la respuesta inmune adaptativa 16-18. Entre tales "…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

Materials

BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
Ficoll-Paque  Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich  P4458-100ML  
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
staphylococcal enterotoxin B  Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
toxic shock syndrome toxin 1  Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
PBS Life Technologies 10010-049
Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
phenol Red-free HBSS  Life Technologies 14175-103
Hepes Fisher Scientific BP299-100
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
pEGFP-Actin Clontech 6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
 Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
 Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
 Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
Delta-T plates Bioptechs 04200415B
Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
 ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
 Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

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Cite This Article
Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

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