Summary

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

Published: December 24, 2015
doi:

Summary

Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.

Abstract

وينظم المناعة التكيفية التي كتبها التفاعلات الدينامية بين الخلايا T ومستضد الخلايا ("ناقلات الجنود المدرعة ') يشار إليها باسم" نقاط الاشتباك العصبي المناعية. داخل هذه الواجهات خلية خلية الحميمة مجموعات فرعية الخلوية منفصلة من MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير شكل واعادة تشكيلها بسرعة. ويعتقد أن هذه الديناميات أن تكون العوامل الحاسمة من كفاءة ونوعية الاستجابات المناعية التي تقوم بتطوير وبالتالي حماية مقابل حصانة مرضية. الفهم الحالي للنقاط الاشتباك العصبي المناعية مع فيزيولوجي ناقلات الجنود المدرعة محدودة بسبب عدم كفاية القرار تصوير الحصول عليها. رغم أن النماذج الركيزة الاصطناعية (مثل طبقات ثنائية الدهون مستو) توفر قرار ممتاز، وكانت أدوات قيمة للغاية، فهي بطبيعتها غير فيزيولوجي والتبسيط. ظهرت الأوعية الدموية واللمفاوية الخلايا البطانية بمثابة حجرة الأنسجة الطرفية هامة (أو اللحمية) من "شبه مهنةآل ناقلات الجنود المدرعة. هذه ناقلات الجنود المدرعة (التي تعبر عن معظم الآلات الجزيئية المهنية ناقلات الجنود المدرعة) لديها ميزة فريدة من تشكيل سطح الخلية مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هنا إحدى الوسائل الأساسية لتنفيذ الخلايا البطانية كما رواية وفيزيولوجي "مستو نموذج APC الخلوي 'لتحسين التصوير والاستجواب من عمليات إشارات المستضدات الأساسية سوف يمكن وصفها.

Introduction

T الليمفاوية هي فرع من نظام المناعة التكيفية التي تتميز القدرة على التعرف على كفاءة الببتيد المستضد (حج) منضمة إلى رئيسي معقد التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات من خلال مستقبلات الخلايا T الخاصة بهم (TCRs) 1. اللمفاويات السذاجة تهاجر بشكل جوهري ومسح "حج تقديم الخلايا المهنية" (ناقلات الجنود المدرعة، على سبيل المثال، والخلايا الجذعية) داخل الغدد الليمفاوية، بينما تحتاج خلايا الذاكرة / T المستجيب لدراسة فعالية مجموعة واسعة جدا من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا المستهدفة المحتملة داخل الأنسجة الطرفية.

في دقيقة بعد الاعتراف الأولي وما شابه ذلك حج على APC، الخلايا اللمفية اعتقال هجرتهم والبدء في تشكيل الحميمة واجهة خلية خلية متخصصة تسمى "المشبك المناعي" (IS). أصيب (أي 30-60 دقيقة) هو يطلب من الاتصالات لتضخيم والحفاظ يشير 2-7. دراسات الناشئة تحديد ذلك ضمن IS، هو تشكيل المستمر وص السريعemodeling من الإشارات المنفصلة شبه الخلوية مجموعات صغيرة (أي التي تحتوي على MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير) التي تحدد قوة وجودة الناتج الاستجابات المناعية 2-7. ومع ذلك، تفاصيل ديناميكية وآلية تنظيمية لهذه العملية هي غير مفهومة تماما 8،9. هذا نابع إلى حد كبير من التحديات الفنية المرتبطة طبولوجيا عدم انتظام السطوح APC والتوجه سيئة تسيطر الطائرات التفاعل خلية خلية، المسائل التي تحد عميقا في التصوير الزمانية المكانية اللازمة النهج 10/08 (Figure1A).

الشكل 1

الشكل 1. فسيولوجي مستو نموذج APC خلية التصوير المناعية سنبس حيوية. ويوضح التخطيطي التصوير التقليدي للالمشبك المناعي بين الخلايا التائية والمهنيه نال APC (A) والخلايا التائية ومستو الدهون النموذج التقليدي طبقة ثنائية APC (B) بالمقارنة مع هذه البطانية نموذج مستو APC رواية (C). توفر ناقلات الجنود المدرعة المهنية نقاط الاشتباك العصبي المناعية الفسيولوجية ولكن تقدم سيئة موجهة اجهة خلية خلية (أي فيما يتعلق طائرة التصوير س ص المثلى؛ والقرار ~ 0.2 ميكرون)، والذي يعرض للخطر بشكل كبير المكاني (طائرة التصوير ض قرار ~ 1 ميكرون)، والزمانية (أي، بسبب الحاجة لمسح مرارا وتكرارا من خلال جميع الطائرات ض التصوير) قرار من التصوير. نماذج طبقة ثنائية لديها طوبولوجيا مستو الذي يوفر الأمثل القرار التصوير الزمانية المكانية، ولكن أيضا مبسطة للغاية، غير الفسيولوجية وجامدة. هذا النموذج الخلايا البطانية يجمع بين طوبولوجيا مستو من طبقات ثنائية الدهون مع الركيزة الفسيولوجية من APC الكلاسيكية لتقديم الأمثل القرار التصوير المكاني والزماني في وضع فيزيولوجي.م / ملفات / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العمل السابق والتحايل جزئيا على هذه العقبات من خلال تطوير نماذج مستو الركيزة (أي طبقات ثنائية الدهون والأسطح المغلفة الأجسام المضادة) التي توفر قرار الزمانية المكانية الأمثل (أي عن طريق تحديد T تنشيط الخلايا السطحية في خطة واحدة التي هي موازية لتصوير س ص الأمثل الطائرة) 11-15 (الشكل 1B). وقد سهلت هذه النماذج معلومات هامة في ديناميات التحت خلوية / الجزيئية التي تتحكم في الإشارات المستضدات في الخلايا T، بما في ذلك اكتشاف الأكتين ديناميكية / TCR يشير-مجموعات الصغيرة 7،11-14. ومع ذلك، فإن التبسيط بطبيعتها مثل هذه النماذج، وكذلك جامدة (النافية للتنمية / دراسة الخصائص الطبوغرافية 3-الأبعاد) (الشكل 1B). ولذلك، فإنه لا يزال غير مؤكد كيفية ربط هذه النتائج إلى فيزsiologic خلية خلية المراقبة المناعية.

وإن كان لا يزال دراسة سلوكه، الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاوية آخذة في الظهور كما كبيرة (أي أكبر في أعداد من جميع ناقلات الجنود المدرعة المهنية، التي كتبها ~ 1000 مرات) حجرة الطرفية من "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة 16-18. هذه الخلايا تعبر عن MHC-I-، MHC-II- وعدد كبير من الجزيئات المشارك مشجعا (على سبيل المثال، CD40، LFA3، ICOSL، 4-1BB، OX40L، TL1A، PD-L1، ولكن لا CD80 CD86 و) وهي استراتيجيا وضعه في واجهة الأنسجة الدموية التي يعملون فيها وظائف الحارس المتخصصة 16-18. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا البطانية على نحو فعال إعادة تحفيز المستجيب / الذاكرة، ولكن ليس ساذجا، وخلايا T 19-25. وبالتالي، من المرجح أن يلعب أدوار APC فريدة من نوعها في المرحلة المستجيب من الاستجابات المناعية التكيفية داخل الأنسجة الطرفية، مثل التأثير المحلي على T تنشيط الخلايا، والتمايز، والذاكرة والتسامح 16،17،26 الخلايا البطانية. CRItically، عندما نمت في المختبر، الخلايا البطانية شكل سطوح الخلايا مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هذه الميزات هي مثالية عالية الدقة التصوير الزمانية المكانية لديناميات الطوبوغرافية خلال التفاعلات خلية خلية 19،27. وهكذا الخلايا البطانية قد تكون بمثابة فيزيولوجي "مستو الخلوي APC" النموذجية مناسبة مميزة لدراسة آليات إعادة التحت خلوية / الجزيئية التي تدفع الاعتراف مستضد وتنظيم الاستجابات (الشكل 1C) 19،20.

أنشئت سابقا تقنيات التصوير التكميلية (بما في ذلك ترنسفكأيشن من خلايا بطائن مع صانعي بروتين فلوري من غشاء البلازما والعصارة الخلوية) لدراسة تفاصيل تفاعل الكريات البيض البطانية خلال الالتصاق والهجرة transendothelial 27، أظهرت أن الكريات البيض تسبر بنشاط سطح البطانة التي كتبها ديناميكية الإدراج فيد تراجع من ميكرون نطاق الفرعي، نتوءات أسطواني الأكتين الغنية (~ 200-1،000 نانومتر في القطر والعمق) يطلق مثل invadosome نتوءات (أي، "ILPs ') 27،28. تم زيادة توسيع هذه النهج التصوير جنبا إلى جنب مع إنشاء بروتوكولات للاستفادة من البطانية وظيفة APC لتطوير أساليب الأولى لارتفاع القرار التصوير الزمانية المكانية للT خلايا البطانية المشبك المناعي كما ورد 19،20 وكذلك وصف هذا القانون. وكان من النتائج المركزي المستمدة من هذه مستو رواية الخلوية نموذج APC هو أن T ILPs خلية تعمل سواء في تعزيز الكشف حج الأولي والحفاظ على الإشارات اللاحقة. في الواقع، صفائف ILPs متعددة (التي استقرت والمستحقة في الرد المبدئي تدفق الكالسيوم) عرض تخصيب اليورانيوم في TCR والجزيئات توحي الإشارات النشطة مثل PKC-Q، ZAP-70، فسفوتيروزين وHS1. ولذلك، يبدو ILPs لتمثيل يعادل فيزيولوجي ثلاثي الأبعاد لالجزئي TCR-إشاراتمجموعات ينظر في نماذج طبقة ثنائية مستو. هذا النهج، وبالتالي، يكشف بحساسية / تقارير الديناميات الجزيئية والهندسة المعمارية (والضمنية النشاط الحيوي) لا يمكن كشفها خلاف ذلك.

الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة يجب أن يكون مفيدا في سد الفجوة بين APC المهنية والصناعية نماذج الركيزة APC من أجل تعزيز قدرتنا على استجواب الآليات الأساسية من الاستجابات المناعية التكيفية. بينما هنا يتم التركيز على تفعيل CD4 + TH1 من نوع المستجيب / خلية الذاكرة، وهذا النهج الأساسي يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا T وقسم الخدمات الزراعية، كما هو مبين أدناه.

Protocol

وتجرى جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع خلايا T الإنسان الأساسية والخلايا البشرية الأولية المتاحة تجاريا البطانية يجب الموافقة على (عن طريق الجلد أو الرئتين الاوعية الدموية الدقيقة ECS). أي بروتوكول البحوث التي تجرى على البشر من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ويجب تقديم مو?…

Representative Results

وقد تم تطوير نهج التصوير رواية باستخدام الخلايا البطانية والجمع بين مزايا حل مستو طبقات ثنائية الدهون النموذج مع تعقيد فيزيولوجي والتشوه المهنية ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1). الشكل 2 أمثلة للهجرة نموذجية، تدفق الكالسيوم ودينام…

Discussion

عموما، يصف هذا البروتوكول أساليب التحقيق الخلايا البطانية وأنا) الكافي في ناقلة جنود مصفحة الفسيولوجية والثاني) كنوع من رواية 'مستو نموذج APC الخلوي. وفيما يتعلق السابق، فقد أصبح موضع تقدير على نحو متزايد أن ناقلات الجنود المدرعة غير لدم الطرفية (أو اللحمية ') تلعب…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

Materials

BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
Ficoll-Paque  Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich  P4458-100ML  
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
staphylococcal enterotoxin B  Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
toxic shock syndrome toxin 1  Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
PBS Life Technologies 10010-049
Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
phenol Red-free HBSS  Life Technologies 14175-103
Hepes Fisher Scientific BP299-100
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
pEGFP-Actin Clontech 6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
 Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
 Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
 Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
Delta-T plates Bioptechs 04200415B
Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
 ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
 Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

References

  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
  3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
  4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
  6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell – dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
  7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
  8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
  9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
  10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
  13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
  15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
  16. Martinelli, R., Carman, C. V., Bradshaw, R. A., Stahl, P. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. , (2015).
  17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
  18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?. Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
  19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
  20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
  21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
  22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
  23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
  24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
  25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
  26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
  27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
  28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by ‘invadosome-like protrusions’. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
  29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
  30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
  31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
  32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
  33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
  34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
  35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
  36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
  37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

Play Video

Cite This Article
Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

View Video