Summary

مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

Published: October 08, 2015
doi:

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia 1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity 3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity 5. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail 6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C 7. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 7. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. تنقية الموسومة GST GTPase الثقافة وE. كولاي سلالة مثل BL21 تحولت مع pGEX-RAC1 O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة، في 500 مل من وسائل الإعلام autoinduction (25 ملي نا 2 هبو 4 و 25 ملي KH 2 PO 4، 50 ملي NH 4 الكلورين، 5 مم نا 2 SO 4، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 0.5٪ الجلسرين، 0.05٪ الجلوكوز، اللاكتوز 0.2٪، 5 ز تريبتون، 2.5 غرام خلاصة الخميرة، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين). البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج، 4 ° C. بيليه resuspend الجرثومي في 20 مل كاشف استخراج البروتين، 1X مثبط البروتياز واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT مع انقلاب. توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 30 دقيقة. إضافة 2 مل الجلوتاثيون حبات مغناطيسية، وغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل). احتضان لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية. تغسل حبات محملة البروتين أربع مرات مع 10 مل PBS، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة. و resuspend حبات في 2 مل PBS وتخزين البروتين تحميلها في -80 درجة مئوية في 100 مكل لحين الحاجة إليها. 2. التعبير عن البروتينات ملزم GTPase قبل يوم من التجربة، transfect البلازميدات ترميز البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) -tagged نسخ من كل بروتين ملزمة GTPase إلى منفصلة 75 سم 2 قارورة من HEK293T على النحو التالي. للتأكد من صحة النوكليوتيدات تحميل، transfect GFP الموسومة TrioD1 إلى الثالثة 75 سم 2 قارورة من HEK293T. تمييع polyethylamine إلى 1 مغ / مل في 100 ميكرولتر العقيمة 150 ملي كلوريد الصوديوم. إضافة 27 ميكرولتر المخفف polyethylamine إلى 223 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل. إضافة DNA البلازميد 12 ميكروغرام إلى 250 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل. احتضان كل أنبوب لمدة 2 دقيقة في RT. </لى> الجمع بين polyethylamine وDNA تختلط في أنبوب واحد ودوامة لمدة 2 دقيقة. احتضان لمدة 15-20 دقيقة في RT. استبدال وسائط النمو (التعديل النسر وسائل الإعلام Dulbecco و، 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، لا المضادات الحيوية) على 90٪ متكدسة HEK293T مع 5 مل وسائط النمو الطازجة. إضافة مزيج polyethylamine / DNA مجتمعة إلى القارورة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. 3. تنقية البروتينات ملزم GTPase شطف قوارير من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في برنامج تلفزيوني واستنزاف قارورة لمدة 5 دقائق، الشفط سائل حر. كشط الخلايا في 500 ميكرولتر العازلة تحلل (50 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.8)، 1٪ Nonidet P-40، 1X مثبط البروتياز) في microfuge أنبوب. الخلايا ليز عن طريق خلط التي كتبها قلب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال تحلل، وغسل قطعتين من 40 ميكرولتر الخرز GFP-فخ ثلاث مرات مع العازلة تحلل العذبة، والخرز المترسبة في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل. توضيح لست] بواسطة الطرد المركزي في 21000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل أوضح المحللة من كل من البروتينات منافس لفصل غسلها الخرز GFP فخ والسماح البروتينات GFP الانصهار لربط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية. إبقاء المحللة من خلايا GFP-TrioD1 على الجليد. غسل تحميل حبات GFP-فخ مرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.8)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7٪ (ث / ت) Nonidet P-40، ومرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 ، المترسبة الخرز في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل. أزل البروتينات GFP الانصهار بإضافة 40 ميكرولتر 0.2 M جليكاين (الرقم الهيدروجيني 2.5) وpipetting صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية. على الفور الخرز الرواسب في 21000 x ج لمدة 60 ثانية ونقل السائل إلى أنبوب microfuge جديدة تحتوي على 4 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 10.4). القيام بذلك بسرعة للحد من الأضرار التي لحقت البروتين النقي. تحليل 1 ميكرولتر من كل من البروتين النقي لطخة الغربية والتحقيق مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP لإنشاء العائد النسبي باستخدام بلوت الكمينظام جي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. بدلا من ذلك، تحديد تركيزات البروتين bicinchoninic حمض (BCA) فحص ولكن هذا يدخل الأخطاء إذا البروتينات لا تتفاعل مع مقايسة بطريقة متطابقة أو هناك البروتينات الملوثة. التعادل تركيز البروتين المولي من خلال إضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2. 4. النكليوتيد تحميل GTPase ذوبان الجليد قسامة واحدة من GST-RAC1 حبات مغناطيسية، الذي أعد في الخطوة 1. خذ 90 ميكرولتر من الخرز GST-RAC1 ويغسل ثلاث مرات مع 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة. العازلة نضح من الخرز وإضافة 100 ميكرولتر 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA. وفقا لما إذا الناتج المحلي الإجمالي، GTP أو لا النوكليوتيدات تحميل مطلوب للتجربة المنافسة، إضافة 12 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، و 12 ميكرولتر 10 ملي غوanosine 5 '- [γ-ثيو] ثلاثي الفوسفات (GTPγS) أو أي النوكليوتيدات إلى 60 ميكرولتر الخرز GST-RAC1. لعناصر النوكليوتيدات التحميل، وتقسيم حبات المتبقية إلى ثلاث قسامات 10 ميكرولتر وإضافة 2 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، 2 ميكرولتر 10 ملي GTPγS أو لا النوكليوتيدات إلى كل أنبوب. احتضان يمزج حبة لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع الإثارة. استقرار RAC1 محددة النوكليوتيدات طريق إضافة 1 M MgCl 2: 3 ميكرولتر إلى المزيج التجريبي (الخطوة 4.4)، و 0.5 ميكرولتر إلى كل من يمزج السيطرة (الخطوة 4.5). 5. مسابقة ملزمة. اقامة 6 أنابيب microfuge، كل منها يحتوي على: 200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7) 5 ميكرولتر البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت) لكل أنبوب، إضافة 0، 1، 2.5، 5، 10 أو 20 ميكرولتر ملزم RAC1 البروتين B (بروتين ملزمة متغير). تفترض هذه الكميات لpproximately قد تحتاج إلى تعديل تركيزات الأسهم متساوية من البروتينات ملزمة ثابتة ومتغيرة و. ضبط كميات من البروتينات ملزمة A و B إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في الانتماءات الملزمة من اثنين من البروتينات، وهذا ينبغي أن تحدد تجريبيا من خلال تكرار التجارب. يشكلون إجمالي حجم الخليط ملزم إلى 235 ميكرولتر بإضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2. إنشاء أنبوب microfuge تحتوي على: 200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7) 10 ميكرولتر من البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت) إعداد الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS ولا أنابيب السيطرة النوكليوتيدات: 200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 10 المراقبة ميكرولتر الخرز RAC1 تحميل في الخطوة 4.5 مع الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS أو لا النوكليوتيدات واستقرت في الخطوة 4.7. 180 ميكرولتر HEK293T GFP-TrioD1 المحللة، أعد كما في الخطوة 3.6 4 ميكرولتر 1 M MgCl 2 احتضان الخليط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية. تغسل حبات ثلاث مرات مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2. أزل ملزمة البروتينات في 20 ميكرولتر الحد من عينة العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7)، 5٪ SDS، 20٪ الجلسرين، 0.02 ملغ / مل برموفينول الأزرق، 5٪ β المركابتويثانول). 6. تحليل المنافسة حل 10 ميكرولتر من بروتين ملزمة (الخطوة 5.6) بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) وصمة عار الغربية. احتضان الغشاء في 4 درجات CO / N في مكافحة GFP الضد المخفف 1/1000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين 20 للكشف عن كل من البروتينات ملزم GTPase المعلمة. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20. احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في RT في DyLight 800 مترافق المضادة للأرنب ثانيةالأجسام المضادة ondary، المخفف 1/10000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين-20. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20. مسح الغشاء باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء، وذلك باستخدام برنامج لقياس شدة الموجات وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. مؤامرة كثافة عصابة من كل من البروتين ضد حجم المنافس متغير (البروتين B). تقسيم حجم منافس متغير عند النقطة التي تتقاطع خطوط من حجم منافس ثابت (البروتين A، 5 ميكرولتر) لتحديد نسبة منافس الذي يتحقق التوازن. للتأكد من صحة الوضع النووى والتحميل، والأغشية التحقيق لتنشيط P21 كيناز 1 (PAK1) (وهو المستجيب) وGFP-TrioD1 (أ GEF)، كما هو موضح في الخطوات 6،1-6،6.

Representative Results

تم تصميم هذا البروتوكول لحساب الانتماءات النسبية للشركاء ملزمة لRAC1، دون الحاجة لمعرفة تركيز دقيق من المنافسين (الشكل 1). تحديد تركيز البروتين يدخل الأخطاء وعند النظر المنافسة بين الجزيئات في مسار الإشارات ليست هناك حاجة. ومع ذلك، فمن المهم أن نعرف أن المنافسين لهما نفس التركيز المولي في الحلول الأسهم للسماح نسب بسيطة يتم حسابها عند إضافة وحدات التخزين المختلفة للفحص. 40 ميكرولتر من الخرز GFP-فخ لديها قدرة ملزمة من ~ 300 بمول لذلك متموجة 75 سم 2 قوارير للتعبير عن درجة عالية من الخلايا سوف تشبع الخرز، وكانت النتيجة أن الاستعدادات لاثنين من البروتينات ملزمة مختلفة ستكون مشابهة قبل التعديل (الشكل 2A). إذا كان أحد البروتينات عن سيئة، ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تنقية أن البروتين من قارورة أكثر من واحد من الخلايا. <p claق ق = "jove_content"> الربط من معظم المؤثرات GTPase والمنظمين يعتمد على النوكليوتيدات التحميل من GTPase الطعم، لذلك من المهم لاختبار ما إذا كان يتم تحميل بنجاح. يمكن التحقق من التحميل من قبل عجل البروتينات ملزمة يعرف من الخلية لست]. البروتينات المستجيب، مثل PAK1 ربط لGTP-RAC1 ويمكن عجلت بسهولة من لست] واكتشفت قبل الغرب النشاف 8 (الشكل 2B). GEFs ربط تفضيلي لالنوكليوتيدات خالية من GTPase لتحقيق الاستقرار في الحالة الانتقالية. كما GEFs هي وفرة منخفضة، عادة غير نشط وكثيرا صمة عار على نحو رديء، فمن الأفضل أن بإفراط لمرفق البيئة العالمية أو جزء مرفق البيئة العالمية لاختبار خالية من النوكليوتيدات GTPase. ونحن كثيرا ما تستخدم لأول تناظر DBL من الثلاثي، معبرا عنه كنسبة الانصهار GFP (GFP-TrioD1 9) (الشكل 2B) ولكن سيعمل أي مرفق البيئة العالمية. البروتينات التي تربط لGTPase محملة الناتج المحلي الإجمالي هي أكثر ندرة. نحن ذكرت مؤخرا RCC2 واحدة هذا البروتين 7، أو الناتج المحلي الإجمالي التحميل يمكن التحقق من صحة كمجرد بيندينانوغرام للا GEF ولا المستجيب. وخرج من هذه التجربة أن يكون لطخة غربية يصور اثنين من الشركاء الموسومة GFP ملزم منضمة إلى GTPase. باستخدام الأجسام المضادة واحد للكشف عن كل من البروتينات، وتركيزات التي كميات مماثلة من كل من المنافسين ربط يمكن تحديد وبالتالي الاستدلال على الانتماءات النسبية. في هذا المثال المنافسة بين المجال المروحة من البروتين الاتجار RAC1، ويتجلى coronin-1C (RAC1 ملزم البروتين A)، والبروتين RAC1-عزل، RCC2 (RAC1 ملزم البروتين B)، (الشكل 3A). باستخدام حجم ثابت من المروحة coronin-1C (5 ميكرولتر)، وإضافة كميات متزايدة من RCC2، يمكننا أن نرى من GFP صمة عار أن يتم التوصل إلى التوازن في 1،25 حتي 2،5 ميكرولتر من RCC2 (النجمة)، مما يدل على أن RCC2 لديها أقوى تقارب لRAC1 من coronin-1C. عن طريق قياس كثافة العصابات باستخدام النشاف الغربي الكمي، والتآمر متوسط ​​القيم لكل منافسهص، يمكن حساب نقطة التوازن بدقة من خلال تحديد الكميات التي تتقاطع المنحنيات (الشكل 3B). واحدة من العقبات الممكنة لمقايسة المنافسة الناجح هو إذا كان الشركاء ملزم ربط بعضها البعض وكذلك ملزمة لRAC1. في الشكل 3A + B نظهر المنافسة بين RCC2 والمجال المروحة من coronin-1C، بدلا من كامل طول coronin-1C. والسبب في استخدام coronin اقتطاع هو أن coronin-1C أيضا يربط RCC2 من خلال المجال الذيل. عند معاير كامل طول coronin-1C ضد RCC2، ملزمة لكل من البروتينات يتم الكشف، وذلك بسبب تشكيل الثلاثي المعقد، بدلا من المنافسة (الشكل 3C). إذا منافسة يحدث، ملزمة للبروتين واحد سيزيد في حين ينخفض ​​أخرى، وسوف مجموعه ملزمة GFP الانصهار تظل ثابتة. في الحالات التي يشكل مجمع الثلاثي فمن الضروري لاقتطاع واحد من البروتين ملزم GTPase بحيث competitors لم يعد التفاعل. الشكل 1. سير العمل. تمثيل تخطيطي لسير العمل لتحديد تقارب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. التحقق من تنقية البروتينات. (A) تنقية RAC1 البروتينات التي حللها لطخة غربية ملزمة، التحقيق مع مكافحة GFP لتحديد العائد النسبي من اثنين من البروتينات الموسومة GFP. هذا النوع من معادلة أثناء التجربة يسمح للتركيز البروتينات اثنين إلى تعديل بحيث أنها تطابق في التجربة ملزمة. (B) GDوقد حضنت P، GTPγS وعدم تحميل النوكليوتيدات GST-RAC1 مع المحللة من HEK293T معربا عن GFP-TrioD1 والبروتينات الكشف عنها بواسطة بالتآمر لPAK1 الذاتية أو overexpressed GFP-TrioD1 ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. تحليل لطخة غربية من البروتين النسبي ملزمة. مخرجات مثال من المقايسات ملزمة المنافسة. تحميلها الناتج المحلي الإجمالي (A) كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-coronin-1C المروحة نطاق وزيادة حجم GFP-RCC2 ومعاير فيها بواسطة النشاف الغربي البروتينات ملزمة لGFP، وتجنب القضايا مع الكشف عن الفرق من اثنين من البروتينات وإشارة GFP تقارير النسبة المولية بين اثنين من البروتينات الانصهار. العلامات النجمية تشير إلى نسب المنافسة على eitheتم قياس الجانب ص من نقطة التوازن. (B) شدة الفرقة من المربوطة البروتينات GFP الانصهار من ثلاث تجارب مستقلة قبل الغرب النشاف الكمي، وذلك باستخدام الأجسام المضادة والمتوسطات الثانوية fluorophore مترافق تآمرت لحساب كمية RCC2 اللازمة للوصول إلى التوازن. (C ) الناتج مثال من التجربة حيث ربط البروتينات RAC1 ملزم لبعضها البعض وتشكل مجمع الثلاثي، بدلا من التنافس. ومعاير كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-RCC2 وزيادة حجم-GFP coronin-1C كامل طول محملة الناتج المحلي الإجمالي فيها والزيادة في المربوطة GFP-coronin-1C دون فقدان ملزمة GFP-RCC2 يشير تشكيل معقد ثلاثي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays 10. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication 7. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Wellcome Trust grant 088419 to MDB.

Materials

Bugbuster Novagen 70584-3
COMPLETE protease inhibitor Roche 05 056 489 001
Glutathione magnetic beads Pierce 88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma Aldrich 408727-100ML
OPIMEM Life Technologies 31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270-1-6
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
GFP-Trap_A Chromotec gta-20
GDP Sigma Aldrich G7127 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS Sigma Aldrich G8634 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer Sigma Aldrich B6429
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Anti-GFP antibody Living Colors 632592 Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody Fisher Scientific 10733944
Anti-PAK1 antibody Cell Signaling 2602S Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System Li-cor 9260-11PC

References

  1. Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
  2. Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
  3. Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
  4. Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
  5. Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
  6. Del Pozo, ., A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
  7. Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
  8. Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
  9. Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
  10. Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).

Play Video

Cite This Article
Williamson, R. C., Bass, M. D. Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays. J. Vis. Exp. (104), e53254, doi:10.3791/53254 (2015).

View Video