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生物学

La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

Published: October 08, 2015
doi:
10.3791/53254
,
1School of Biochemistry,University of Bristol, 2Department of Biomedical Science,University of Sheffield

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia 1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity 3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity 5. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail 6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C 7. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 7. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. Purificación de la GTPasa GST-etiquetados Cultura una E. cepa de E. coli tales como BL21 transformadas con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, en 500 ml de medio de autoinducción (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucosa, 0,2% de lactosa, 5 g de triptona, 2,5 g extracto de levadura, 100 mg / ml de ampicilina). Cosecha bacterias por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg, 4 ° C. Resuspender sedimento bacteriano en 20 ml de reactivo de extracción de proteínas, inhibidor de la proteasa 1x y se incuba durante 20 min a TA con inversión. Aclarar el lisado por centrifugación a 40.000 xg durante 30 min. Añadir perlas magnéticas 2 ml de glutatión, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM). Incubar durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C. Lavar perlas de proteína cargada por cuatro veces con 10 ml de PBS, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso. Resuspender perlas en 2 ml de PBS y tienda de proteína cargada-a -80 ° C en 100 ml de alícuotas hasta que se necesite. 2. Expresión de proteínas de unión a GTPasa- El día antes del experimento, los plásmidos que codifican transfectar proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados versiones de cada proteína de unión GTPasa en una separada de 75 cm 2 frasco de HEK293T como sigue. Para la validación de la carga de nucleótidos, marcado con GFP transfectar TrioD1 en una tercera de 75 cm 2 frasco de HEK293T. Diluir polyethylamine a 1 mg / ml en 100 l estéril NaCl 150 mM. Añadir 27 l polyethylamine diluido a 223 l de suero reducido de medios de comunicación. Añadir 12 g de ADN plasmídico a 250 l de suero reducido de medios de comunicación. Incubar cada tubo durante 2 minutos a RT. </li> Combinar el polyethylamine y el ADN se mezcla en un solo tubo y agitar durante 2 min. Incubar durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Reemplazar los medios de crecimiento (medio Eagle modificado por Dulbecco, 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, sin antibióticos) en 90% confluentes HEK293T con 5 ml de medio de crecimiento fresco. Añadir la mezcla de polyethylamine / ADN combinado al matraz y se incuba O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. 3. Purificación de proteínas de unión a GTPasa- Enjuague frascos de células transfectadas en PBS y drene matraz durante 5 minutos, aspirar líquido libre. Raspe células en 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibidor de la proteasa) en tubo de microcentrífuga. Lisar células mediante la mezcla por inversión a 4 ° C durante 30 min. Durante la lisis, lavar dos lotes de 40 mu l perlas de GFP-TRAP tres veces con tampón de lisis fresco, perlas sedimentan en 2700 xg durante 2 min entre lavados. Aclarar los lisados ​​por centrifugación a 21.000 xg durante 10 min. Transferencia aclaró lisado de cada una de las proteínas de la competencia para separar las perlas lavadas GFP-trampa y permiten proteínas GFP-fusión que se unen durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C. Mantenga lisado de células GFP-TrioD1 en hielo. Lavar perlas de GFP-TRAP cargados dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), NaCl 50 mM, 0,7% (w / v) de Nonidet P-40 y dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 2 , sedimentación cuentas a 2700 xg durante 2 minutos entre lavados. Eluir proteínas de fusión GFP-mediante la adición de 40 l 0,2 M glicina (pH 2,5) y pipeteando arriba y abajo durante 30 segundos. Cuentas inmediatamente los sedimentos a 21.000 xg durante 60 s y traslade el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 4 l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Haga esto rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada. Analizar 1 l de cada proteína purificada por Western blot y la sonda con un anticuerpo anti-GFP para establecer rendimiento relativo usando un blott cuantitativasistema ing según el protocolo del fabricante. Alternativamente, determinar las concentraciones de proteínas por ácido (BCA) de ensayo bicinconínico pero esto introduce errores si las proteínas no reaccionan con el ensayo de una manera idéntica o hay proteínas contaminantes. Igualar la concentración de proteínas molar mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2. 4. nucleótidos carga de GTPasa Descongelar una alícuota de perlas magnéticas GST-Rac1, preparado en el paso 1. Tomar 90 l de perlas de GST-Rac1 y lavar tres veces con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso. Tampón Aspirar a partir de perlas y añadir 100 l 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM. De acuerdo a si el PIB, GTP o ninguna carga de nucleótidos se requiere para el experimento de competición, añadir 12 l PIB 100 mM, 12 mM l gu 10anosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTP? S) o no nucleótidos a 60 mu l perlas de GST-Rac1. Para los controles de nucleótidos de carga, dividir las perlas restantes en tres alícuotas de 10-mu l y añadir 2 l PIB mM 100, 2 l 10 mM GTP? S o ninguna de nucleótidos a cada tubo. Incubar las mezclas de perlas durante 30 minutos a 30 ° C con agitación. Estabilizar Rac1 de nucleótidos unida por la adición de 1 M MgCl 2: 3 l a la mezcla experimental (paso 4,4), 0,5 mu l a cada una de las mezclas de control (paso 4.5). 5. Competencia vinculante. Configure 6 tubos de microcentrífuga, conteniendo cada uno: 200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2 10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7) Proteína 5 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante) A cada tubo, añadir unión Rac1-0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l de proteína B (proteína de unión variable). Estos volúmenes asumen unaproximadamente pueden necesitar ser ajustado concentraciones madre iguales de las proteínas de unión constantes y variables y. Ajuste el volumen de proteínas de unión A y B si hay grandes diferencias en las afinidades de unión de las dos proteínas y esto debe determinarse empíricamente a través de las repeticiones experimentales. Completar el volumen total de la mezcla de unión a 235 l mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. Establecer un tubo de microcentrífuga que contiene: 200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2 10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7) Proteína 10 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante) Configure el PIB, GTPyS y no hay tubos de control de nucleótidos: 200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2 10 cuentas de Rac1 de control mu l cargados en el paso 4.5 con el PIB, GTPyS o ninguna de nucleótidos y se estabilizaron en el paso 4.7. 180 l HLisado EK293T GFP-TrioD1, preparado como en el paso 3.6 4 l 1 M de MgCl 2 Incubar la mezcla durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C. Lavar las perlas tres veces con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl 2. Eluir con destino proteínas en 20 l tampón de muestra reductor (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol). 6. Análisis de la competencia Resolver 10 l de la proteína unida (paso 5.6) por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y Western blot. Incubar la membrana a 4 ° CO / N en anticuerpo anti-GFP diluyó 1/1000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20 para detectar tanto de las proteínas de unión a GTPasa-etiquetados. Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20. Incubar la membrana durante 30 min a TA en DyLight 800 sec-conjugado anti-conejoanticuerpo secundaria, se diluyó 1 / 10.000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20. Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20. Analiza la membrana usando un sistema de imagen de infrarrojos, utilizando el software para medir la intensidad de la banda de acuerdo con el protocolo del fabricante. Trazar la intensidad de la banda de cada proteína en función del volumen del competidor variable (proteína B). Divida el volumen de competidor variable al punto en el que las líneas se cruzan por el volumen de competidor constante (Proteína A, 5 l) para determinar la relación de competidor a la cual se alcanza el equilibrio. Para la validación de la condición de nucleótidos de carga, las membranas de la sonda de p21-quinasa activada 1 (PAK1) (un efector) y GFP-TrioD1 (un FMAM), como se describe en los pasos 6.1-6.6.

Representative Results

Este protocolo está diseñado para calcular las afinidades relativas de los socios de unión para Rac1, sin la necesidad de conocer la concentración exacta de los competidores (Figura 1). Determinación de la concentración de proteína introduce errores y cuando se considera la competencia entre las moléculas en una vía de señalización no es necesario. Sin embargo, es importante saber que los dos competidores tienen la misma concentración molar en las soluciones madre para permitir relaciones simples para ser calculada cuando la adición de diferentes volúmenes para el ensayo. 40 l de perlas de GFP-TRAP tienen una capacidad de unión de ~ 300 pmol por lo que un confluente 75 cm 2 frascos de altamente células que expresan saturará los granos, con el resultado de que las preparaciones de las dos proteínas de unión diferentes serán similares antes del ajuste (Figura 2A). Si una de las proteínas expresa pobremente, este problema se puede superar mediante la purificación de que la proteína de más de un matraz de células. <p class = "jove_content"> La unión de la mayoría de los efectores GTPasa y reguladores depende de la nucleótido-carga de la GTPasa cebo, por lo que es importante para probar si la carga ha sido exitosa. La carga puede ser verificada mediante la precipitación de las proteínas de unión conocida a partir de lisados ​​celulares. Proteínas efectoras, tales como PAK1 se unen a GTP-Rac1 y pueden ser fácilmente precipitaron a partir de lisados ​​y se detectaron por transferencia Western 8 (Figura 2B). GEFs unirse preferentemente al nucleótido libre de GTPasa para estabilizar el estado de transición. Como GEFs son de baja abundancia, por lo general inactivo y con frecuencia blot mal, es mejor que sobreexpresan un FMAM o fragmento del FMAM a prueba GTPasa nucleótidos libres. Con frecuencia usamos la primera homología Dbl de Trio, expresado como una fusión GFP (GFP-TrioD1 9) (Figura 2B) pero cualquier FMAM iba a funcionar. Las proteínas que se unen a la GTPasa PIB cargadas son más raros. Recientemente hemos informado de rcc2 como una de esas proteínas 7, o el PIB de carga puede ser validado simplemente como binding a ni GEF ni efector. La salida del experimento será una transferencia Western que representa las dos parejas de unión GFP-etiquetados unidos a la GTPasa. Mediante el uso de un único anticuerpo para detectar ambas proteínas, las concentraciones a las que cantidades similares de ambos competidores se unen pueden ser determinados y por lo tanto las afinidades relativas reales. En este ejemplo, la competencia entre el dominio de la hélice de la proteína Rac1 la trata, coronin-1C (Rac1-proteína de unión a A), y la proteína Rac1-secuestro, rcc2 (Rac1-proteína de unión B), se demuestra (Figura 3A). Mediante el uso de un volumen constante de la hélice coronin-1C (5 l), y la adición de volúmenes crecientes de rcc2, podemos ver de la GFP blot que el equilibrio se alcanza a 1,25-2,5 l de rcc2 (asterisco), lo que demuestra que tiene un fuerte rcc2 afinidad por Rac1 que coronin-1C. Mediante la medición de la intensidad de las bandas utilizando transferencia Western cuantitativa, y el trazado de los valores medios para cada competitor, el punto de equilibrio se puede calcular con precisión mediante la identificación de los volúmenes en el que las curvas se cruzan (Figura 3B). Uno de los posibles obstáculos para un ensayo de competición éxito es si las parejas de unión se unen entre sí, así como la unión a Rac1. En la Figura 3A + B se demuestra la competencia entre rcc2 y el dominio de la hélice de coronin-1C, en lugar de larga duración coronin-1C. La razón para usar el coronin truncada es que coronin-1C también se une rcc2 a través del dominio de la cola. Cuando de larga duración coronin-1C se valora contra rcc2, se detecta la unión de ambas proteínas, debido a la formación ternario complejo, en lugar de la competencia (Figura 3C). Si la competencia se está produciendo, la unión de una proteína aumentará, mientras que la otra disminuye, y total unida GFP-fusión se mantendrá constante. En los casos en que se forma un complejo ternario es necesario truncar una de la proteína de unión a GTPasa de modo que la competITORS ya no interactúan. Figura 1. Flujo de trabajo. Representación esquemática del flujo de trabajo para determinar la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Validación de proteínas purificadas. (A) purificada GFP-etiquetados Rac1 proteínas analizadas por Western blot de unión, sondando con anti-GFP para determinar el rendimiento relativo de las dos proteínas. Este tipo de ecualización durante el experimento permite la concentración de las dos proteínas que se puede modificar para que coincidan en el experimento de unión. (B) GDP, GTPyS y ningún nucleótido-cargado GST-Rac1 se incubó con lisado de HEK293T que expresan GFP-TrioD1 y proteínas detectadas por el trazado de PAK1 endógena o sobreexpresado GFP-TrioD1 obligados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Western blot de proteína en relación vinculante. Salidas Ejemplo de ensayos de unión con la competencia. Cargó-PIB (A) Rac1 se mezcló con 5 l GFP-coronin-1C dominio hélice y el aumento de los volúmenes de las buenas prácticas agrarias-rcc2 se valora en. Por Western Blot proteínas unidas para GFP, problemas con la detección diferencial de las dos proteínas se evitan y la señal de GFP informes de la relación molar entre las dos proteínas de fusión. Los asteriscos indican las relaciones de competencia en eithelado r del punto de equilibrio. (B) Banda intensidades de proteínas de fusión GFP encuadernados de tres experimentos independientes se midieron mediante transferencia Western cuantitativa, usando anticuerpos y promedios secundarios fluoróforo conjugado conspiraron para calcular la cantidad de rcc2 necesario para alcanzar el equilibrio. (C ) Ejemplo de salida de un experimento donde las proteínas de unión a Rac1 se unen entre sí y forman un complejo ternario, en lugar de competir. PIB-cargado Rac1 se mezcló con 5 l GFP-rcc2 y volúmenes crecientes de-GFP coronin-1C de larga duración se titularon. El aumento de la cota GFP-coronin-1C sin pérdida de cota GFP-rcc2 indica la formación del complejo ternario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays 10. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication 7. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Wellcome Trust grant 088419 to MDB.

Materials

Bugbuster Novagen 70584-3
COMPLETE protease inhibitor Roche 05 056 489 001
Glutathione magnetic beads Pierce 88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma Aldrich 408727-100ML
OPIMEM Life Technologies 31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10270-1-6
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
GFP-Trap_A Chromotec gta-20
GDP Sigma Aldrich G7127 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS Sigma Aldrich G8634 Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer Sigma Aldrich B6429
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Anti-GFP antibody Living Colors 632592 Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody Fisher Scientific 10733944
Anti-PAK1 antibody Cell Signaling 2602S Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System Li-cor 9260-11PC
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References

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Williamson, R. C., Bass, M. D. Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays. J. Vis. Exp. (104), e53254, doi:10.3791/53254 (2015).
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