The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Nous avons construit de manière covalente linéaires fermés minivectors (LCC) d'ADN comme un gène-vecteur de délivrance alternative non-virale produite par une simple plate – forme in vivo. Ministrings d'ADN possèdent un profil accru de sécurité et aussi efficacement livrer la cargaison d'ADN à des cellules ciblées. des vecteurs d'ADN classiques comportent des séquences procaryotiques indésirables, y compris les gènes de résistance aux antibiotiques, des motifs CpG, et les origines bactériennes de replication, ce qui peut conduire à la stimulation des réponses immunitaires de l'hôte. La biodisponibilité des vecteurs d'ADN classiques est également compromise en raison de leur taille moléculaire plus grande. Leur nature circulaire peut également conférer une intégration chromosomique, conduisant à la mutagenèse insertionnelle.
des séquences bactériennes sont excisés à partir minivectors d'ADN, ne laissant que le gène d'intérêt (GOI) et des éléments d'expression eucaryotes nécessaires. Nos minivectors d'ADN de LCC, ou Ministrings d'ADN, sont dépourvus de séquences bactériennes immunogènes; par conséquent, l'amélioration de thbiodisponibilité eir et d'expression GOI. Dans le cas de l'intégration du vecteur dans le chromosome, le MiniString d'ADN LCC lethally perturber le chromosome de l'hôte, ce qui élimine le mutant potentiellement dangereux de la population cellulaire proliférante. Par conséquent, Ministrings d'ADN offrent les avantages de l'ADN 'minicercle', tout en éliminant le risque d'événements d'intégration de vecteur indésirables. En comparaison avec les plasmides classiques et leurs homologues (CCC) fermé de manière covalente circulaire isogéniques, Ministrings d'ADN montrent la biodisponibilité supérieure, l'efficacité de transfection et la cinétique cytoplasmiques – ils nécessitent donc des quantités plus faibles d'agents tensioactifs cationiques pour la transfection efficace des cellules cibles.
Nous avons construit une seule étape dans le système inductible in vivo pour la production d'Ministrings d'ADN dans Escherichia coli , qui est simple à utiliser, rapide et évolutive.
L'objectif est de produire des quantités évolutives de linéaire fermé de façon covalente minivectors (LCC) d'ADN en utilisant un système in vivo de production de MiniString d'efficacité simple et haute en une seule étape chaleur inductible ADN. Ministrings d'ADN fournissent une stratégie non-virale sûre et efficace pour fournir l'ADN. Ils combinent la sécurité des vecteurs LCC avec l'efficacité de minicercles d'ADN, et offrent également une alternative plus sûre à des vecteurs dérivés de virus, sans compromettre l'efficacité de la transfection.
Pour un système de délivrance de transgène pour réussir, le vecteur d'ADN doit entrer dans la cellule hôte cible et d'exprimer le transgène (s) codé. Il existe plusieurs barrières cellulaires qui doivent être surmontés dans la pratique, en particulier dans les systèmes de mammifères. Afin d'éviter la dégradation par les nucleases sériques et de la détection par le système immunitaire réticulo-endothélial, le vecteur d'ADN doit être bio- et immuno-compatible avec le système cible. ADN Unprotected est rapidement digéré par les nucléases de plasmaet la membrane de plasmide est constitué de barrières de lipoprotéines denses, de sorte que le vecteur d'ADN doit être capable de traverser rapidement la membrane plasmique des cellules cibles. Une fois dans la cellule, les vecteurs doivent traverser le cytoplasme et passer à travers la membrane nucléaire pour pénétrer dans le noyau pour l'expression du transgène. Les techniques non-virales livraison de gènes se concentrent sur le renforcement de la cellule tissulaire et de ciblage. Cependant, l'utilisation de plasmides traditionnels avec ces techniques permet de réduire l' efficacité de transfection en raison de la présence de séquences bactériennes immunogènes, ce qui réduit au silence l' expression du gène rapidement 1,2. les plasmides classiques comportent généralement des gènes de résistance aux antibiotiques pour l'entretien dans les systèmes procaryotes. Cependant, ceux-ci peuvent produire des effets indésirables potentiels chez les hôtes humains ou conférer une résistance à la flore d'accueil d'origine naturelle par des effets de transfert de gène horizontal. Les plasmides classiques contiennent également des motifs dinucléotide CpG 2, ce qui peut déclencher une réponse immunostimulatrice non désirée, ce qui pourraitréduire ou faire taire l'expression du transgène.
Comme ils sont uniquement constitués de la cassette d'expression eucaryote, minivectors d'ADN, tels que minicercles d'ADN 3, sont une meilleure alternative pour la livraison de gènes car ils présentent une biodisponibilité améliorée extracellulaire et intracellulaire et l' amélioration de l' expression des gènes en raison de leur taille réduite et de l' absence d'éléments procaryotes immunostimulantes 4. Le vecteur tarifs de taille réduite par rapport à une meilleure résistance aux forces de cisaillement associées à l' administration in vivo à un site cible 5. Le nombre plus élevé de copies du vecteur par unité de masse nécessite moins un réactif de transfection, ce qui diminue la toxicité. Toutefois, en cas d'intégration du vecteur aléatoire dans un chromosome hôte, circulairement de manière covalente (CCC) des vecteurs, y compris les deux minicercles d'ADN et des plasmides classiques fermés, conférer une continuité moléculaire et peut donc conduire à la mutagenèse insertionnelle, ce qui peut avoir des conséquences dévastatrices <sup> 6. En comparaison, l' intégration d'un vecteur d'ADN linéaire perturbe le chromosome et déclenche les voies de la mort cellulaire, ce qui élimine la cellule mutante à partir de la population de cellules en prolifération et la prévention de la mutagenèse insertionnelle 7. Minimalistic expression du gène immunologiquement défini (MIDGE) vecteurs 8 et micro-linéaire des vecteurs 9 (MiLV) sont des vecteurs LCC ADN développés in vitro. Vecteurs de MIDGE ont montré jusqu'à une amélioration de l' expression du transgène de 17 fois in vivo par rapport à l' ADN plasmidique classique vecteurs 11, et ont démontré des résultats prometteurs dans le traitement vaccin 10 et le cancer 8 gène. En outre, en raison de la structure sans torsion du minivector LCC moins un réactif de transfection est nécessaire par rapport à la contrepartie CCC surenroulé, réduisant ainsi la toxicité 7.
Nos vecteurs d'ADN de LCC améliorés, Ministrings d'ADN, ont démontré l'efficacité et la bioavai d'expression supérieure7 labilité. En outre, Ministrings d'ADN sont produites sur un système in vivo de la production de chaleur inductible par une étape, une solution pratique et rentable à la cécidomyie et MiLV LCC vecteurs, qui nécessitent des étapes multiples in vitro. Le système de production de MiniString d'ADN à démontrer est un processus thermique inductible simple , réalisée in vivo, ce qui en fait à la fois rentable et facilement évolutive. Ce système exploite le bactériophage Yersinia enterocolitica PY54 dérivé Tél / pal protelomerase système de recombinaison 12 pour séparer la cassette d'expression eucaryote minimale du squelette de plasmide procaryote. Nous avons conçu Escherichia coli cellules (W3NN) pour exprimer Tel protelomerase sous le contrôle du bactériophage λ promoteur inductibles par la chaleur, cI [Ts] 857 13. Lors de l' expression, Tel protelomerase agit sur les sites actuels cibles de pal à l' intérieur " de Super Sequence" (SS) sites situés sur le plasmide précurseurpour donner des produits LCC, à partir duquel le MiniString d'ADN peut ensuite être purifié (figure 1). Les sites SS sur le plasmide précurseur de MiniString d'ADN codent également pour les sites cibles pour les autres recombinases , notamment la recombinase Cre (loxP), TELN protelomerase (telRL) et la recombinase FLP (FRT), ce qui facilite ainsi la production de LCC isogénique et minivectors CCC d'un plasmide précurseur. De plus, chaque site de SS est flanquée des deux côtés par SV40 (SV40e) des séquences qui servent à améliorer la 14 translocation nucléaire. Nous avons démontré ailleurs que l' addition successive de SV40e confère progressivement des augmentations correspondantes de l' efficacité de transfection 7. Le plasmide précurseur (ADNp MiniString ou PDMS) contient un polylieur (figure 1) pour faciliter l' insertion d'un gène d'intérêt souhaité en fusion transcriptionnelle avec le rapporteur fluorescente verte (GFP).
La technologie de l'ADN peut minivectorêtre utilisés à la place des procédés classiques pour le transfert de gènes, l'expression de gènes rapporteurs, et les évaluations vers l'efficacité de l'expression du transgène dans des systèmes eucaryotes. Ministrings d'ADN combinent la biocompatibilité et l'augmentation des gains d'efficacité de transfection de "mini" vecteurs avec le profil de sécurité supérieur de vecteurs d'ADN linéaires. Notre solide plate-forme de production en une seule étape rapide et facilement produit Ministrings d'ADN pour toute demande de transfert de gènes et offre un profil de sécurité supérieur.
Nous décrivons ici un système simple pour la production de Ministrings LCC ADN en utilisant un protocole de chaleur inductible une seule étape, qui ne nécessite aucun équipement spécial en dehors de ce qui est utilisé dans la croissance bactérienne typique et la manipulation. Ministrings d'ADN sont stables linéaires des cassettes d'expression d'ADN libre en torsion, dépourvu d'éléments génétiques procaryotes. Ils peuvent être utilisés à la place des procédés classiques pour le transfert de gènes, l'expression de gènes rapporteurs, ainsi que dans les évaluations vers l'efficacité de l'expression transgénique dans des systèmes eucaryotes. Ministrings d'ADN combinent la biocompatibilité et l'augmentation des gains d'efficacité de transfection de "mini" vecteurs avec le profil de sécurité supérieur de vecteurs d'ADN linéaires. Notre seule étape robuste dans la plate – forme de production in vivo rapidement et facilement produit Ministrings d'ADN pour toute application de transfert de gène sans avoir besoin de plusieurs processus in vitro coûteux.
Il y a plusieurs étapes critiques àassurer une production optimale de MiniString (figures 2 et 3). induction de chaleur est l'étape la plus critique pour Ministring production. Absence totale de Ministring production est très probablement due à l'absence d'induction de chaleur (cellules conservées à 30 ° C), où la répression de l'expression protelomerase empêche la conversion du précurseur plasmide LCC MiniString. En suivant le protocole d'induction de la chaleur, attendre un rendement d'environ 75% de la production. induction de la chaleur est optimale alors que les cellules sont en phase logarithmique. Bien qu'il n'y ait pas de différence statistiquement significative dans Ministring PE lors de l' utilisation des cellules en phase stationnaire ( "Overgrown", Figure 3), nous avons observé une diminution de près de 50% du rendement global de plasmide. Les rendements dépendent du protocole d'extraction du plasmide utilisé. Pour la production de MiniString optimale, déclencher l'induction de la chaleur tandis que les cellules sont en phase logarithmique. Mauvaise production MiniString sera très probablement un résultat de longue upshift ou insufficie températurent rétrogradage de température. Prolongée upshift de température est déconseillée car cela active le E. coli réponse de choc thermique 15, qui peut inhiber l' activité de protelomerase et interférer avec la stabilité du plasmide. Par conséquent, le calendrier rétrogradage de température est une autre étape essentielle pour une production efficace de MiniString. Sans temps d'incubation supplémentaire à 30 ° C, Ministring efficacité de la production a été jugée très faible ( «retrait anticipé», Figure 3). Cela peut être attribué à la quantité de temps nécessaire pour l'expression et l'activité Tél. L'origine prophage encodage PY54 Tel protelomerase infecte normalement Yersinia, qui croît de façon optimale autour de 28 ° C 12, qui indique que 30 ° C peut également être plus optimale pour l' activité de Tel.
Le système de production d' ADN minivector utilise une plate – forme in vivo pour générer bactériennes minivectors d'ADN libre de séquence de haute qualité. Les modifications apportées au protocole peut inclure modifiant les milieux de croissance pour optimiser le plasmide et la production de protéines dans le but de promouvoir la croissance des cellules pendant la phase de croissance (TB au lieu de LB), ou augmenter Ministring production et l'efficacité de conversion. Pour de plus grands volumes de culture (200 ml et plus), rétrogradage de température et d'incubation à 30 ° C peut être prolongée pendant une nuit sans grave impact négatif sur Ministring PE. Nous avons inclus des modifications dans notre protocole pour 500 ml de cultures à titre d'exemple. Purification de Ministrings d'ADN peut être accéléré par la digestion in vitro endonucléase du squelette procaryotes. Il y a un certain nombre de sites cibles d'endonucléase (par exemple, PI-Scel, Pvul, Scal) disponible sur le squelette procaryotes du plasmide précurseur, qui peut être coupé pour exposer linéaire extrémités ouvertes, permettant la dégradation in vitro de l'épine dorsale procaryotes. L' isolement de Ministrings provenant d' autres espèces de vecteur peut également être réalisée par chromatographie sur membrane échangeuse d'anions 16.
Une limitation de courant associé au système de production de vecteurs LCC ADN est la nécessité d'une purification de l'ADN provenant MiniString d'autres produits LCC et CCC. Bien purifié facilement à l'aide des méthodes d'isolement de plasmide standard, l'étape d'isolement peut encore être un inconvénient dans un cadre à grande échelle. La séparation de la MiniString peut prendre du temps en utilisant AGE si le MiniString et l'épine dorsale procaryote LCC sont aussi de taille similaire. En variante, la Chromatographie sur membrane d'échange d'anions peut fournir une meilleure séparation des Ministrings à partir d' espèces de vecteurs CCC 16. Température upshift peut être une autre limitation potentielle que des températures élevées activent également la réponse de choc thermique dans E. coli, ce qui affecte négativement la protéine recombinante donne 17 et de réduire par conséquent les taux de plasmide Ministring conversion. Nous rapportons ailleurs des optimisations de la plate – forme de production pour contourner et / ou d' atténuer ces effets de choc thermique 18. noussont également optimiser actuellement des méthodes pour éliminer ou réduire la contamination LCC squelette procaryotes in vivo.
l'intégration chromosomique de l'ADN MiniString LCC perturbe le chromosome de l'hôte et soumet la cellule à l'apoptose. Non seulement cela réduit conséquences négatives potentielles de mutagenèse insertionnelle tels que l'oncogenèse et le silençage des gènes adjacents, ce qui améliore sa sécurité; l'effet létal peut également servir d'une méthode idéale pour knock-in et des études de remplacement de gène sans les effets secondaires associés et les dégâts de l'intégration. Vecteurs ADN MiniString peuvent être appliquées vers le transfert et l' expression de gènes pour des protéines thérapeutiques, de l' ARN, des anticorps ou des antigènes dans une cible donnée in vivo ou remplacer un allèle fonctionnel mal- ou non. Le inductible par la chaleur in vivo système de production simple en une étape permet de vecteurs d' ADN MiniString d'être facilement produites pour des applications cliniques et industrielles.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et pour le financement de ces travaux.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |