The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
بنينا الخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) DNA باسم الجينات التسليم بديل ناقلات غير الفيروسية المنتجة عبر منصة بسيطة في الجسم الحي. ministrings الحمض النووي تمتلك محة سلامة مشددة وأيضا كفاءة تسليم البضائع الحمض النووي للخلايا المستهدفة. ناقلات الحمض النووي التقليدية تحمل تسلسل الكائنات الحية بدائية غير مرغوب فيها، بما في ذلك الجينات للمضادات الحيوية المقاومة، زخارف الدليل السياسي الشامل، وأصول البكتيرية النسخ المتماثل، مما قد يؤدي إلى تحفيز استجابات المناعية المضيف. ويؤثر سلبا على التوافر الحيوي للناقلات الحمض النووي التقليدية أيضا نظرا للحجم الجزيئي. قد طبيعة دائرية لها أيضا نقلها التكامل الكروموسومات، مما يؤدي إلى الطفرات إقحامي.
يتم استئصال تسلسل البكتيرية من minivectors الحمض النووي، ولم يتبق سوى الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) وعناصر التعبير حقيقية النواة الضرورية. لدينا minivectors LCC الحمض النووي، أو ministrings الحمض النووي، وتخلو من متواليات البكتيرية المناعية. وبالتالي تحسين عشرالتوافر البيولوجي الاستخراجية والتعبير الحكومة الإسرائيلية. في حال والتكامل ناقلات في كروموسوم، فإن ministring LCC الحمض النووي يعطل قاتل الكروموسوم المضيفة، مما يزيل متحولة يحتمل أن تكون خطرة من السكان الخلايا المتكاثرة. ونتيجة لذلك، ministrings DNA تقديم فوائد الحمض النووي "minicircle" حين القضاء على إمكانية أحداث التكامل ناقلات غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع البلازميدات التقليدية والتي إسوي مغلقة تساهمي (CCC) نظرائهم دائرية، ministrings الحمض النووي تثبت التوافر البيولوجي المتفوق والكفاءة ترنسفكأيشن، وحركية هيولي – وبالتالي فإنها تتطلب كميات أقل من السطحي الموجبة لترنسفكأيشن فعالة من الخلايا المستهدفة.
لقد شيدت على بعد خطوة واحدة محرض في نظام الجسم الحي لإنتاج ministrings الحمض النووي في القولونية التي هي سهلة الاستخدام وسريعة، وقابلة للتطوير.
والهدف هو انتاج كميات قابلة للخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) الحمض النووي باستخدام كفاءة بسيطة وعالية من خطوة واحدة في الجسم الحي DNA نظام الإنتاج ministring للحرارة محرض. توفير ministrings DNA استراتيجية آمنة وفعالة غير الفيروسية لإيصال الحمض النووي. فهي تجمع بين سلامة ناقلات LCC مع كفاءة minicircles الحمض النووي، وأيضا توفر بديلا آمنا للناقلات المشتقة من الفيروس دون المساس كفاءة ترنسفكأيشن.
من أجل نظام تسليم التحوير لتكون ناجحة، يجب على ناقلات الحمض النووي يدخل الخلية المضيفة الهدف والتعبير عن التحوير المشفرة (ق). وهناك العديد من الحواجز الخلوية التي يجب التغلب عليها في الممارسة العملية، لا سيما في أنظمة الثدييات. من أجل تجنب تدهور التي كتبها nucleases المصل وكشف المناعي عن طريق الجهاز الشبكي البطاني، يجب أن يكون ناقلات الحمض النووي الحيوية والمناعة متوافق مع النظام المستهدف. يتم هضم الحمض النووي دون وقاية بسرعة nucleases البلازماويتكون الغشاء البلازميد الحواجز البروتين الدهني كثيفة جدا ناقلات الحمض النووي يجب أن تكون قادرة على عبور بسرعة غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة. مرة واحدة في الخلية، ويجب أن ناقلات اجتياز السيتوبلازم وتمر عبر الغشاء النووي لدخول نواة للتعبير عن التحوير. وتركز تقنيات توصيل الجينات غير الفيروسية على تعزيز نسيجيا وخلية استهداف. ومع ذلك، فإن استخدام البلازميدات التقليدية مع هذه التقنيات يقلل من كفاءة ترنسفكأيشن بسبب وجود تسلسل البكتيرية المناعية، التي تسكت بسرعة التعبير الجيني 1،2. البلازميدات التقليدية عادة ما تحمل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية للصيانة في أنظمة بدائية النواة. ومع ذلك، هذه قد تنتج الآثار الضارة المحتملة في المضيف البشري أو نقلها مقاومة طبيعيا النباتات المضيفة عن طريق اثار نقل الجينات الأفقي. تحتوي على البلازميدات التقليدية أيضا ثنائي النوكليوتيد الدليل السياسي الشامل الزخارف 2، والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابة يمونوستيمولاتوري غير المرغوب فيها، ويحتملخفض أو إسكات التعبير التحوير.
كما تتألف بشكل حصري من الكاسيت التعبير حقيقية النواة، minivectors الحمض النووي، مثل minicircles الحمض النووي 3، هي البديل الأفضل لتوصيل الجينات كما أنها تظهر تحسين التوافر البيولوجي خارج الخلية والخلايا وتحسين التعبير الجيني نظرا لانخفاض حجمها وغياب عناصر بدائية يمونوستيمولاتوري 4. انخفاض حجم فارس متجه نحو أفضل فيما يتعلق مقاومة قوى القص المرتبطة في إدارة الجسم الحي إلى موقع الهدف 5. عدد نسخة أعلى من ناقلات لكل وحدة كتلة يتطلب أقل ترنسفكأيشن الكاشف، وبالتالي تقليل سمية. ومع ذلك، في حالة من التكامل ناقلات عشوائي في الكروموسوم المضيف، دائري تساهميا مغلقة (CCC) ناقلات، بما في ذلك minicircles الحمض النووي والبلازميدات التقليدية ونقلها استمرارية الجزيئية، وبالتالي قد تؤدي إلى الطفرات إقحامي، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة <sتصل> 6. نسبيا، والتكامل من ناقلات الحمض النووي الخطي يعطل كروموسوم ويبدأ مسارات موت الخلايا، مما يزيل خلايا متحولة من السكان الخلايا المتكاثرة ومنع الطفرات إقحامي 7. أضيق الحدود ناقلات الجينات المحددة مناعيا (ذبابة) 8 وناقلات الصغيرة الخطي 9 (MiLV) هي ناقلات LCC الحمض النووي وضعت في المختبر. وقد عرضت ناقلات ذبابة تصل إلى 17 أضعاف تحسن التعبير التحوير في الجسم الحي مقارنة ب DNA البلازميد التقليدية ناقلات 11، وأظهرت نتائج واعدة في لقاح 10 و السرطان 8 العلاج الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لهيكل خالية من التواء من minivector LCC، مطلوب أقل كاشف ترنسفكأيشن بالمقارنة مع CCC supercoiled نظيره، وبالتالي تقليل سمية 7.
وقد أثبتت لنا تعزيز ناقلات LCC الحمض النووي، ministrings الحمض النووي، والكفاءة العالية والتعبير bioavaiتقلقل 7. وعلاوة على ذلك، يتم إنتاج ministrings الحمض النووي على المجراة نظام الإنتاج للحرارة محرض خطوة واحدة، وهو البديل المناسب وفعالة من حيث التكلفة لذبابة وMiLV LCC ناقلات، والتي تتطلب خطوات متعددة في المختبر. نظام الإنتاج ministring الحمض النووي ليكون أظهر هو عملية للحرارة محرض بسيطة أجريت في الجسم الحي، مما يجعلها على حد سواء فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير بسهولة. يستغل هذا النظام يرسينيا القولون عاثية المستمدة PY54 أبيب / بال protelomerase نظام إعادة التركيب 12 لفصل الحد الأدنى من حقيقيات النوى كاسيت التعبير من العمود الفقري البلازميد في بدائيات النواة. لقد المهندسة الإشريكية القولونية الخلايا (W3NN) للتعبير عن أبيب protelomerase تحت سيطرة للحرارة محرض الجراثيم λ المروج، CI [تس] 857 13. على التعبير، تل protelomerase يعمل على مواقع بال الهدف موجودة داخل مواقع تقع على البلازميد السلائف "سوبر تسلسل" (SS)لانتاج منتجات LCC، والتي من ministring الحمض النووي يمكن بعد ذلك تنقيته (الشكل 1). مواقع SS على DNA البلازميد ministring السلائف أيضا تشفير المواقع المستهدفة لrecombinases الأخرى بما في ذلك لجنة المساواة العرقية recombinase (السلمون المدخن)، TelN protelomerase (telRL) وFLP recombinase (FRT)، مما يسهل إنتاج LCC إسوي وminivectors CCC من البلازميد السلائف واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، ويحيط كل موقع SS على كلا الجانبين من SV40 محسن (SV40e) متواليات، التي تعمل على تحسين النبات النووي 14. لقد أثبتنا في أماكن أخرى أن إضافة المتعاقبة من SV40e يمنح تدريجيا الزيادة المقابلة في كفاءة ترنسفكأيشن 7. البلازميد السلائف (PDNA MiniString أو PDMS) يحتوي على polylinker (الشكل 1) لتسهيل إدخال أي الجين المطلوب من الاهتمام في الانصهار النسخي مع مراسل الفلورية الخضراء (GFP).
تكنولوجيا الحمض النووي minivector قدأن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، والتقييمات نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات "مصغرة" مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية منصة الإنتاج خطوة واحدة بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات، ويقدم صورة الأمان العالي.
نحن هنا وصف نظام بسيط لإنتاج ministrings LCC الحمض النووي باستخدام بروتوكول للحرارة محرض خطوة واحدة، والذي لا يتطلب أي معدات خاصة ما عدا ذلك الذي يستخدم في نمو البكتيريا نموذجي والتلاعب. ministrings الحمض النووي هي خالية من التواء، مستقرة خطية أشرطة التعبير الحمض النووي، وتخلو من العناصر الوراثية بدائية النواة. أنها يمكن أن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، وكذلك في تقييم نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات "مصغرة" مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية خطوة واحدة في منصة إنتاج الجسم الحي بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات من دون الحاجة إلى عمليات مكلفة متعددة في المختبر.
هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان أفضل إنتاج ministring (الشكلان 2 و 3). الحث الحراري هو الخطوة الأكثر أهمية لministring الإنتاج. انعدام تام للministring الإنتاج على الأرجح بسبب عدم وجود تحريض الحرارة (خلايا الاحتفاظ بدرجة حرارة 30 درجة مئوية)، حيث قمع التعبير protelomerase يمنع تحويل البلازميد تمهيدا لministring LCC. بعد بروتوكول تحريض الحرارة، ونتوقع كفاءة إنتاج ما يقرب من 75٪. الحث الحراري هو الأمثل في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. على الرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في ministring PE عند استخدام الخلايا في مرحلة ثابتة ( "شديد النمو"، الشكل 3)، ونحن لم نلاحظ تقريبا انخفاضا بنسبة 50٪ في العائد البلازميد بشكل عام. سيعتمد العائد على بروتوكول استخراج البلازميد المستخدمة. لإنتاج ministring الأمثل، وتحريك الاستقراء الحرارة في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. سوف إنتاج ministring الفقراء من المرجح أن تكون نتيجة لupshift درجات الحرارة لفترات طويلة أو insufficieالإقليم الشمالي درجة الحرارة بالاستعداد. وتثبيط لفترات طويلة upshift درجة الحرارة لأن ذلك ينشط E. القولونية استجابة الصدمة الحرارية 15، والتي قد تمنع النشاط protelomerase وتتداخل مع استقرار البلازميد. لذلك، توقيت بالاستعداد درجة الحرارة هو خطوة حاسمة أخرى لإنتاج ministring كفاءة. بدون فترة حضانة إضافية عند 30 درجة مئوية، ووجد ministring كفاءة الإنتاج لتكون فقيرة جدا ( "إزالة المبكرة"، الشكل 3). ويمكن أن يعزى ذلك إلى مقدار الوقت اللازم للتعبير أبيب والنشاط. وتنشأ طليعة العاثية ترميز PY54 أبيب protelomerase يصيب عادة يرسينيا، التي تنمو على النحو الأمثل حوالي 28 درجة مئوية 12، مشيرا إلى أن 30 ° C قد يكون أيضا أكثر الأمثل للنشاط أبيب.
نظام الإنتاج الحمض النووي minivector يستخدم منصة في الجسم الحي لتوليد عالية الجودة بكتيريا minivectors الحمض النووي خالية من التسلسل. تعديلات على البروتوكول واسمحوا ليNCLUDE تغيير وسائط النمو لتحسين البلازميد وإنتاج البروتين من أجل تعزيز نمو الخلايا خلال مرحلة النمو (السل بدلا من LB)، أو زيادة ministring إنتاج وتحويل الكفاءة. لكميات أكبر ثقافة (200 مل وأكبر)، بالاستعداد درجة الحرارة والحضانة عند 30 درجة مئوية ويجوز تمديدها ليلة وضحاها دون تأثير سلبي شديد على ministring PE. لقد قمنا بإدراج التعديلات في بروتوكول لدينا 500 مل الثقافات كمثال على ذلك. تنقية ministrings الحمض النووي يمكن التعجيل من خلال المختبر في نوكلياز داخلية الهضم من العمود الفقري في بدائيات النواة. وهناك عدد من المواقع المستهدفة نوكلياز داخلية (على سبيل المثال، PI-SCEI، PvuI، SCAI) متاح في العمود الفقري في بدائيات النواة من البلازميد السلائف، والتي يمكن أن تقطع لفضح خطية مفتوحة تنتهي، والسماح لفي المختبر تدهور العمود الفقري في بدائيات النواة. عزل ministrings من الأنواع ناقلات أخرى يمكن أيضا أن يتحقق من خلال تبادل أنيون غشاء اللوني 16.
واحد الحد الحالي يرتبط مع نظام الإنتاج ناقلات LCC الحمض النووي هو الحاجة إلى تنقية ministring الحمض النووي من غيرها LCC ومجلس التعاون الجمركي المنتجات. على الرغم من أن تنقية بسهولة باستخدام أساليب البلازميد العزلة القياسية، يمكن للخطوة العزلة لا يزال وضع غير مؤات في إعداد نطاق واسع. فصل ministring يمكن أن يكون استخدام AGE إذا كان ministring والعمود الفقري في بدائيات النواة LCC متشابهة جدا في حجم تستغرق وقتا طويلا. بدلا من ذلك، يمكن أن توفر أنيون تبادل غشاء اللوني الفصل أفضل من ministrings من الأنواع ناقلات CCC 16. درجة الحرارة upshift يمكن أن يكون الحد محتمل آخر، لأن درجات الحرارة العالية أيضا تفعيل استجابة الصدمة الحرارية في E. القولونية، مما يؤثر سلبا على البروتين المؤتلف ينتج 17 وبالتالي خفض معدلات البلازميد إلى ministring التحويل. نفيدكم مكان آخر أمثل من منصة الإنتاج للتحايل و / أو تخفيف هذه الآثار من الصدمة الحرارية 18. نحنكما الأمثل حاليا طرق للقضاء أو الحد من التلوث LCC العمود الفقري في بدائيات النواة في الجسم الحي.
التكامل الكروموسومات من ministring LCC الحمض النووي يعطل كروموسوم المضيفة ويخضع الخلية إلى موت الخلايا المبرمج. وهذا لا يقلل الآثار السلبية المحتملة من الطفرات إقحامي مثل تكون الورم وإسكات الجينات المجاورة، وبالتالي تحسين سلامتها. تأثير مميت ويمكن أيضا أن تكون بمثابة وسيلة مثالية للطرق في ودراسات استبدال الجينات من دون آثار جانبية مصاحبة والضرر من التكامل. ويمكن تطبيق ناقلات الحمض النووي ministring من أجل نقل والتعبير عن جينات البروتينات العلاجية، RNA، والأجسام المضادة، أو المستضدات إلى هدف معين في الجسم الحي أو محل الأليل وظيفية شر أو غير. يسمح للخطوة واحدة للحرارة محرض في الجسم الحي نظام الإنتاج بسيط ناقلات الحمض النووي ministring إلى أن تنتج بسهولة لتطبيقات سريرية أو الصناعية.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) لتمويل هذا العمل.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |