Chaînes pour le transport de molécules d'eau dans les enzymes influencent solvatation de site actif et de la catalyse. Nous présentons ici un protocole pour l'ingénierie de ces motifs catalytiques supplémentaires basés sur la modélisation et expériences de l'ordinateur silico. Cela permettra d'améliorer notre compréhension de l'influence de la dynamique de solvants sur la catalyse enzymatique.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
L'eau constitue une pierre angulaire pour la chimie de la vie 1. Modèles d'eau et solvatation des sites actifs des enzymes affectent à la fois l'enthalpie et l'entropie de la liaison 1,2 et 3 catalyse d'une manière très complexe allant au-delà de l'effet hydrophobe 2,3 ligand. RMN 4, calorimétrie 2 et la modélisation moléculaire des protéines solvatées ont été utilisées pour faire la lumière sur le rôle des molécules d'eau explicites à fournir une force motrice pour l'association de ligand 5-8, la spécificité et l'activité 2,9,10. Ici, nous présentons une méthodologie unique pour l'évaluation expérimentale de l'effet thermodynamique de déplacement du solvant sur la catalyse enzymatique (Figure 1). Notre stratégie combinée est basé sur des simulations informatiques de concert avec génie enzymatique et l'analyse thermodynamique (Figure 1). Cela permet de faire la lumière supplémentaires sur l'impact de la dynamique de solvants sur catalyse, qui est actuellement mal comprise.
Stabiliser interactions enthalpiques, fournies par des liaisons hydrogène médiation à l'eau dans l'enzyme solvaté sites actifs, peuvent être compensés par des sanctions entropiques 1. Ces coûts entropiques sont associées à la diminution des degrés de liberté affichée par les molécules d'eau confinés à l'intérieur des cavités de protéine, par rapport à l'eau 5 en vrac. La libération de molécules d'eau commandés peut donc fournir une force motrice entropique pour l'association de ligand 1 et 3 catalyse. Un aspect essentiel de la dynamique de solvant est le déplacement des molécules d'eau entre l'intérieur de protéines et le solvant extérieur 4. Les changements d'accompagnement dans l'énergie d'activation, enthalpie et entropie 11 ne sont pas complètement compris au niveau moléculaire. En obstruant tunnels individuels responsables pour le transport de l'eau dans les enzymes, l'importance de la dynamique de solvant et de sa contribution à l'activationénergie peut être évaluée (Figure 1). En outre, en effectuant un seul récipient expériences cinétiques à différentes températures, les paramètres d'activation thermodynamiques relatives de plusieurs substrats peuvent être extraites à partir d'un nombre réduit d'expériences (figure 1, à droite). Notre méthode interdisciplinaire est validé pour les enzymes triterpène cyclase membranaires complexes qui génèrent des terpènes polycycliques de grande importance pour la vie 12. Le protocole permet la récupération de quantités élevées de protéine de membrane (10-20 mg / L) à l'aide d'une centrifugeuse standard.
Bien que les enzymes ont évolué dans l'eau, le rôle de solvant dans la promotion de la catalyse est généralement négligée. En plus de la dynamique des protéines 13,14 cette forme pré-organisés sites actifs avec complémentarité électrostatique à l'état de transition 15, la dynamique de l'eau pourraient être d'une grande importance pour la catalyse enzymatique efficace. En forgeant plusieurs techniques interdisciplinaires, notreobjectif est de faciliter l'étude très complexe de dynamique de l'eau et de la thermodynamique. Faire ces outils plus accessibles à la communauté scientifique va conduire au développement de nouvelles stratégies en génie enzymatique et la conception de protéines pour les activités et les spécificités modifiées.
Les étapes les plus critiques dans la réalisation de données thermodynamiques expérimentales de haute qualité pour les variantes de l'enzyme de la membrane et des tunnels de type sauvage sont: 1) la génération du modèle d'ordinateur; 2) les protéines purifiées de manière homogène; 3) les stocks de substrat émulsionnées; 4) le contrôle de la température pendant la cinétique; 5) l'extraction de mélanges de réaction en utilisant la norme interne.
La génération du modèle informatique est grandement facilitée par l'utilisation d'un logiciel avec une interface facile à utiliser qui prend en charge une grande variété de plates-formes. Par conséquent, ce protocole est fondée sur la YASARA Modeling Suite 16 pour rendre notre stratégie accessible même à la modélisation des non-spécialistes. Un modèle informatique pour l'identification de tunnel de l'eau devrait idéalement être basé sur une structure cristalline de l'enzyme d'intérêt 24. A cet effet, la richesse des structures cristallines disponibles dans la banque de données de protéines est très bénéfique. Dans notre expérience, un aspect clé dans la préparation réussie de systèmeplaques d'identification du tunnel est de garder les eaux cristallographiques. Il est d'une importance égale à utiliser une boîte d'enzyme solvaté lors de l'exécution simulations de dynamique moléculaire, qui peuvent être exécutés sur un ordinateur normal. Le cyclase triterpénique de Alicyclobacillus acidocaldarius est stable dans l'eau pendant 3 MD simulations. Cependant, le maintien cristallographiques détergents et / ou en utilisant des mimétiques de la membrane cellulaire peut-être pas nécessaire aurait pour enzymes potentiellement instables pour permettre des simulations de MD prolongées. Il est envisagé que la structure cristalline de cibles fortement minimisé difficiles importante pourrait fournir un aperçu mécaniste en utilisant le protocole, bien que cela ne serait pas capturer aspects dynamiques d'organisation du tunnel.
Spéléologue 19 dans le mode de base, avec un seul ou un nombre limité d'instantanés en entrée, peut être utilisée par des non-experts sur un ordinateur portable standard. Basé sur notre expérience 3, tunnels avec un rayon de goulot d'étranglement (par exemple, le rayonau point le plus étroit) inférieur à 1 A peut être très pertinent pour l'eau, surtout si les molécules d'eau cristallographiques résident dans le tunnel prédit (Figure 1, au milieu à gauche). D'autre part, un rayon de goulot d'étranglement plus grande pourrait impliquer un tunnel pour le transport du substrat dans et hors du site actif 10. Le script dans le Code complémentaire fichier 2 peuvent être utilisés par des non-experts pour la visualisation des tunnels prévus. De futures expériences révèlent si les modèles d'homologie seront d'une résolution suffisamment élevée pour permettre l'étude atomistique des réseaux d'eau et de la dynamique. Faire la lumière sur la façon d'effectuer des simulations de dynamique moléculaire, avec et sans ligand présent dans le site actif, influence le processus d'identification du tunnel serait également d'importance.
Cinétique de protéines membranaires peuvent constituer un formidable défi 25. Le protocole ici sont basées sur un protocole d'extraction de simple membranepour obtenir l'enzyme de la membrane sans l'utilisation d'un matériel coûteux, comme une ultracentrifugeuse. L'utilisation de la filtration sur gel comme une étape de polissage finale élimine les particules résiduelles potentiels de membrane et permet de définir un environnement de détergent approprié 25.
Un aspect clé dans la réalisation des résultats reproductibles cinétiques du protocole est pour émulsionner la solution stock de substrat par ultrasons. Tourbillonnement simple de substrats hydrophobes dilué dans le tampon de réaction donne des mélanges non homogènes substrat détergentes. Le pipetage des solutions de substrat non émulsionnées conduit à des concentrations non reproductibles (confirmés par GC quantitative), ce qui empêche une détermination précise du taux initiaux. En revanche, le pipetage des solutions mères convenablement émulsionnés devrait se traduire par une analyse de régression linéaire des taux initiaux avec R 2 dans la plage de 0,98 à 0,99 de. Un autre aspect important de substrats hydrophobes est la solubilité apparente du substratet de la disponibilité dans les mélanges substrat détergentes. En fait, il n'a pas été possible de saturer la cyclase triterpénique avec le squalène de substrat de référence. Pour cette raison apparente k cat / K M valeurs sont présentées ici, qui pourraient contenir des contributions à la fois contraignant et de la chimie. Cependant, il a été montré que la chimie est la limitation du débit pour k cat / K M pour la cascade de polycyclization réalisée par cyclases triterpéniques 3.
Il est très important de vérifier la température réelle à l'intérieur d'un flacon en verre de réaction avec un thermomètre externe. Pourtant, crises linéaires peuvent être plus pauvres pour les variantes avec k apparente cat / valeurs constantes essentielle K M à des températures différentes. Ce point est souligné pour la variante S168F ici (figure 2A) avec une enthalpie d'activation proche de zéro (figure 2B et 2C). Très Small changements dépendant de la température dans apparente k cat / K M, pourraient induire une incertitude dans l'entropie d'activation observée Δ S ‡ (ie, l'interception dans les parcelles linéaires dans la figure 2B). En principe, l'entropie d'activation observé peut également être affectée par une abondance de différentes enzymes actifs pour différentes variantes, qui ne seraient pas détectées par la mesure de la concentration en protéines. Il est prévu que les erreurs expérimentales sont réduits lors du mélange de plusieurs substrats dans un pot. En effet, tous les différents substrats interagissent avec la même quantité d'enzyme dans ces circonstances (équation 4). L'utilisation d'un solvant d'extraction enrichi avec un étalon interne est important de tenir compte des différences au cours de l'extraction et / ou GC-injection.
Théorie de l'état de transition a été utilisé avec succès en enzymologie 26. Ce cadre théorique important a été dépour déve- réactions unimoléculaires dans la phase gazeuse. Cependant, il a été démontré que les enzymes fonctionnent principalement en abaissant la barrière d'énergie d'activation classique 26. Le coefficient de transmission supposé être ici une pourrait affecter l'enthalpie et / ou entropie d'activation mesuré. La contribution de l'effet tunnel, et d'autres effets non classiques tels que repassant de l'état de transition, peuvent contribuer à peu près 1000 fois à la catalyse 26 correspondant à environ 4 kcal / mol dans l'énergie. On peut voir que l'entropie d'activation affichée par l'enzyme de type sauvage (16 kcal / mole à 328 K, la figure 2C) est beaucoup plus important que de tels effets non classiques provoquées par un coefficient de transmission non uniforme. L'impact du coefficient de transmission devrait diminuer lorsque l'on compare les paramètres thermodynamiques d'activation pour les variantes de type tunnel et sauvages utilisant le protocole.
L'énergie libre d'activation (Δ G ‡) est composed la fois d'une enthalpie (Δ H ‡) et une entropique (- T * S Δ ‡) terme. Réorganisation solvant enzymes pendant la catalyse peut influencer les deux paramètres. Le présent protocole est prévu pour faciliter l'étude de ces phénomènes par l'assemblage d'une boîte à outils des outils informatiques pertinents et convivial in silico avec le cadre expérimental biophysique nécessaire. Le procédé est prévu pour être utile pour étudier une pléthore de processus enzymatiques, y compris la catalyse par des enzymes liées à la membrane.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |