Svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi Dynamics a membrana Enzimi

Modellazione 1. In Silico Computer Scarica una struttura PDB della proteina di interesse da parte della banca dati di proteine ​​(PPB). Preparare la struttura, rimuovendo subunità in eccesso e quindi aggiungendo mancanti atomi di idrogeno e solvente esplicito utilizzando la "neutralizzazione delle cellule e p K una previsione" esperimento di YASARA 16. Per membrana legato ciclasi triterpenici, adeguate dimensioni della scatola acqua sono 91x67x77 Å. Regolare lo stato protonazione degli amminoacidi cataliticamente attivi manualmente. Nota: se necessario, un analogo substrato nel file PDB può essere modificato per un vero e proprio supporto utilizzando "Modifica | Swap | Atom" comando. Ridurre al minimo la struttura per il comando "Energia minimizzazione" utilizzando il campo suite di forza AMBER 17. Utilizzare l'approccio a rete particella Ewald (PME) 18 per tener conto a lungo raggio interazioni elettrostatiche. Impostare il limite per van der Waals secondoa impostazioni standard. Nota: Il comando "Energia minimizzazione" elimina lo stress conformazionale da una breve ripida minimizzazione discesa, quindi una ricottura simulata (timestep 2 FSEC, velocità atomo ridimensionato da 0,9 ogni 10 ° passo) viene eseguito fino a raggiungere la convergenza (cioè, il miglioramento di energia da meno di 0.012 kcal / mol per atomo durante 200 gradini). 2. Modello di attivo del sito Solvatazione e accesso dell'acqua Dopo la ricottura simulata, eseguire un 20 dinamica molecolare NSEC (MD) traiettoria e generare almeno 10 immagini dalla "File | Simulazione Istantanea | Salva con nome" comando seguito da "Simulazione On". Eseguire le simulazioni su un computer standard con condizioni al contorno periodiche sotto l'insieme canonico. Mantenere la temperatura a 298 K utilizza un termostato Berendsen. Preparare le istantanee ottenuti da 2.1 cancellando tutte le molecole d'acqua ed eventuali ligandi / substrati utilizzando il4; Modifica | Elimina | Residue "comando Superpose ogni snapshot individualmente sull'originale PDB-struttura per la". Superpose | comando Oggetto "per garantire che tutte le strutture condividono la stessa posizione spaziale Salva ogni istantanea preparata in questo modo come un nuovo progetto preliminare di bilancio. -file (utilizzando il "File | Save as | PDB" di comando). Nota: per modellisti esperti: uno script per automatizzare questo processo in base al modello di cui al Codice supplementare File 1. Utilizzare le istantanee preparate (PDB) da 2.2 che sono stati allineati in 3D-spazio come input per il speleologo software 3.0 19. Per l'analisi di un numero limitato di istantanee, eseguire Caver su un computer standard. Utilizzare un raggio di 0,7 Å sonda 19 per assicurare il rilevamento di gallerie che sono specifici per il trasporto di molecole d'acqua. Visualizzare i tunnel generati da speleologo 3.0 in un software di grafica molecolare. Per una facile visualizzazione di gallerie, utilizzare la macro mostrato in integrativa Codice File 2. 3. In Silico Enzyme Engineering di modificare i modelli di acqua e dinamiche d'acqua Identificare le gallerie più alto ordinati secondo l'intestazione "ID" elencato nel file di output "summary.txt" generato dal software speleologo 3.0. Identificare gli aminoacidi che rivestono i tunnel più alta classifica (3.1) e che mostra una piccola catena laterale che punta verso l'interno del canale mediante ispezione visiva (utilizzando il modello ottenuto dal 2,4). Identificare sostituzioni di singoli aminoacidi che bloccano il tunnel da un aumento sterico utilizzando il comando "Scambia Residue". Verificare che il tunnel è ostruito da ispezione visiva, e quindi ripetendo i passi 1,2-3,1 del protocollo. 4. L'espressione di geni mutati Introdurre le mutazioni nel gene wild-type da Mutagenesi PCR usando primer non sovrapposti 20. Aggiungere DNA plasmide contenente il gene di interesse a tubos con cellule competenti di un ceppo adatto clonazione e incubare in ghiaccio per 30 min. Eseguire una trasformazione shock termico per 45 secondi in un bagno d'acqua con la temperatura impostata a 42 ° C. Aggiungere 500 pl di una ricca mezzo fresco (2YT, 16 g / L di triptone, estratto di lievito 10 g / L, 5 g / L di NaCl) e incubare a 37 ° C, 200 rpm per 45 min. Effettuare una selezione placcando le cellule trasformate su piastre di agar integrati con antibiotici appropriati. Dopo aver verificato la sequenza di DNA del gene mutato, trasformare il DNA plasmidico in un ceppo espressione utilizzando scossa di calore come descritto sopra. Per l'espressione di membrana legati ciclasi triterpenici, utilizzare BL21 (DE3). Avviare un 5 ml O cultura / N a 37 ° C del ceppo espressione 2YT-media integrato con antibiotici appropriati. Inoculare un dibattimento in pallone sconcertato 2 L, contenente 300 ml 2YT-media integrato con antibiotici appropriati, ad una OD finale di 0,05-,09 (misurata a 600 nm). Dopo l'induzione con un diametro esterno di 0,6-0.8 e l'espressione della proteina, congelare il pellet di cellule e conservare a -80 ° C. Per di membrana ciclasi triterpenici in un vettore pD861, indurre con 0,5 a 2 mM ramnosio e 4 ore di espressione a 37 ° C per ottenere alte rese di proteine ​​21. 5. membrana Estrazione con centrifuga normale e purificazione delle proteine Preparare i seguenti buffer: buffer di risospensione (100 potassio fosfato mM, pH 7,5 addizionato di inibitori della proteasi compresse), tampone detergente (1% (v / v) Triton X-100, potassio fosfato 50 mM, pH 7,5) e tampone di reazione (0,2 % Triton X-100, 50 mM potassio fosfato, pH 7.5). Per ciclasi squalene-hopene o altri enzimi legati alla membrana con pH ottimale inferiore, sostituire il fosfato di potassio nel buffer risospensione con citrato. Per tali enzimi utilizzare i seguenti buffer: buffer di detersivo (1% Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) e tampone di reazione (citrato 0,2% Triton X-100, 60 mM, pH 6,0). Nota: se un His-tag viene utilizzato per la purificazione, integrare il buffer di risospensione con imidazolo mm 20 (concentrazione finale). Pesare un pellet di cellule congelate in un bicchiere di vetro. Risospendere le cellule in tampone risospensione utilizzando un omogeneizzatore ad una concentrazione finale di 0,3 g cellule / ml. Lisare le cellule risospese di ultrasuoni con un'ampiezza di 80% e un impulso di 1 sec acceso e 1 sec spento. Utilizzare tre cicli ripetuti di 50 sec ciascuno. Aggiungere tampone detersivo una concentrazione finale di 0,2% (v / v) di detersivo. Equilibrare da end-over-end miscelazione a 4 ° C per 1 ora. Recupero della frazione proteina di membrana salvando surnatante dopo una singola fase di centrifugazione a 39.000 xg per 50 min a 4 ° C. Nota: Se si utilizza His-tag purificazione, aggiungere circa 1,5 ml di Ni-NTA agarosio cellule / g e incubare per 1 ora. Eseguire una prima purificazionepasso da uno scambio ionico o purificazione 21 His-tag. Supplemento le equilibrazione e eluizione buffer con 0,2% Triton X-100. Concentrare la proteina purificata cinque volte utilizzando filtro centrifugo Unità con un cut-off di 10 kDa. Nota: La dimensione del Triton X-100 micelle risultati in una concentrazione di detersivo ad una concentrazione finale di circa 1%. Finalizzare la purificazione da una filtrazione su gel lucidatura passo con la proteina concentrata e una matrice compatibile con una serie di frazionamento per le proteine ​​globulari di 2 × 10 4 × 10 -8 6. Utilizzare il tampone di reazione come tampone di corsa. Misurare la quantità di proteina purificata utilizzando il kit Ultra Bradford secondo il protocollo del produttore. 6. Cinetica Fare un fresco 5 soluzione madre mM di substrato in tampone di reazione. Ottenere un'emulsione omogenea da ultrasuoni al 30% di ampiezza per 2-5 min. Equilibrare un thermomixeralla temperatura di reazione desiderata. Verificare la temperatura all'interno di una fiala di vetro contenente l'acqua da un termometro esterno. Per cinetiche singolo substrato, diluire il substrato emulsionato in almeno cinque fiale di vetro alla stessa concentrazione finale del substrato. Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, preparare almeno cinque fiale di vetro identiche mescolando tutti i supporti in ogni fiala. Per triterpeni idrofobiche, usare concentrazioni di substrato finale nel range di 10-200 micron. Preincubare le fiale di vetro nel thermomixer per 10 min. Avviare la reazione aggiungendo l'enzima. Un volume di reazione totale di 1 ml è adatto. Utilizzare una velocità di agitazione di almeno 1.200 giri al minuto. Fermare le reazioni in diversi momenti con l'aggiunta di 500 microlitri etilacetato spillo con 100 micron decanolo come standard di integrazione. 7. Estrazione e analisi termodinamica Estrarre le miscele di reazione divortex e agitazione manuale, le fiale di vetro vigorosamente per 1 min. Centrifugare i flaconi di vetro a 9.600 xg in una centrifuga da tavolo per 10 minuti a RT. Trasferire lo strato superiore (fase organica) ad un tubo vuoto. Aggiungere un ulteriore 500 ml di estrazione con solventi per le provette di reazione e ripetere la procedura di estrazione. Essiccare le miscele di reazione estratti con Na 2 SO 4. Vortex per 5 secondi e lasciare che i tubi riposare per 10 minuti. Eseguire una fase di centrifugazione finale a 9.600 xg per 1 min a temperatura ambiente usando una centrifuga da tavolo. Trasferire i campioni estratti per gascromatografia (GC) fiale. Ripetere i passaggi sotto 6,1-7,2 per ciascuna variante enzima di interessi, utilizzando almeno quattro diversi concentrazione iniziale del substrato (per cinetiche singolo substrato) e quattro diverse temperature (sia per singolo substrato e la cinetica della concorrenza). Eseguire GC-analisi come descritto precedentemente 3. Utilizzare una colonna non polare per l'analisi di hydrophobic prodotti pentaciclici. Impostare la temperatura iniziale del forno a 120 ° C e utilizzare un gradiente di temperatura di 5 ° C / min, a seconda dei prodotti e la colonna. Integra le aree dei picchi del prodotto (s) e trasformare aree dei picchi prodotto nei corrispondenti concentrazioni del prodotto utilizzando l'area dello standard di integrazione (corrispondente a 100 mM). Tracciare la concentrazione di ciascun prodotto ([P]) in funzione del tempo di reazione (t). Eseguire la regressione lineare dei punti di dati corrispondenti a meno del 10% di conversione. La velocità di reazione iniziale (V 0) è data dalla pendenza della retta secondo: Nota: Per una pentola relativi cinetica con più substrati, V 0 è la velocità iniziale di un particolare substrato sotto l'influenza di altri substrati. Per cinetiche substrato singoli, trama V 0 </sub> / [E] contro le corrispondenti concentrazioni di substrato. Il / valore apparente k cat K M è data dalla pendenza della parte lineare del grafico secondo: [S] è la concentrazione di substrato e [E] la concentrazione di enzima utilizzato nella trasformazione. K cat / K M equivale alla costante catalitico sopra la costante di Michaelis. Ripetere l'analisi per ciascuna temperatura e ogni variante enzima. Per cinetiche singolo substrato, eseguire un'analisi termodinamica secondo passaggio teoria dello stato 22 b k è la costante di Boltzmann, h la costante di Planck, T la temperatura in Kelvin, e R la costante dei gas. Eseguire un'analisi di regressione lineare della trama di ln ((k <sub> cat / K M) / ((k b * T) / h))) rispetto al 1 / T. L'entalpia di attivazione (Δ H ‡) è data dalla (-slope) * R e l'entropia di attivazione (Δ S ‡) è data da (intercetta) * R. Nota: Analogamente, un'analisi sotto saturando concentrazione del substrato può essere eseguita utilizzando k cat come tasso costante nell'equazione 3. Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, ottenere il relativo apparente k cat / valori K M da 23: (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = 0 V, A / V 0, B * [B] / [A] (4) per cui V 0, A si riferisce alla velocità iniziale di substrato A in concorrenza con substrato B. Per uno-pentola relativo kinetics con più substrati, ottenere i parametri termodinamici relativi di attivazione per B, rispetto ad A come riferimento, con la regressione lineare: Calcolare i parametri di attivazione assoluti per substrato B dal entalpia ed entropia di attivazione di riferimento composto A: