Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

Поле нанотоксикологии исследований направлена ​​охарактеризовать биологическое действие наночастиц. Токсикологические исследования, основанные на исследованиях в естественных условиях остаются наиболее точных методов. Тем не менее, их применение ограничено их стоимости, трудовых и временных требований ^1. Как анализы альтернатив, в пробирке были использованы из-за их простоты и возможности разработки высокой пропускной в пробирке тестирования платформ ² – так увеличения количества тестируемых условиях. Большинство nanotoxicological исследования проводили с использованием в анализах пробирке с иммортализованных клеточных линий. Тем не менее, существуют опасения относительно экстраполяции этих экспериментальных данных в естественных условиях токсикологических эффектов ^3. Действительно, свойства иммортализованных клеточных линий может быть существенно отличается от тканей они были получены из, например, генетической трансформации ^4, ухудшение ключевых морфологических признаков5, потеря сотовой полярности ⁶ и функциональных изменений, таких как регулирование медиаторов воспаления ^7.

Клетки Купфера являются наиболее распространенными население макрофагов в организме и непосредственно в контакте с кровью, выравнивая стенки синусоиды печени. В рамках ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), эти макрофаги несут ответственность за захват циркулирующих наночастиц и поэтому представляют собой весьма подходящую модель для изучения наночастиц токсичности. В естественных условиях ⁸ и в пробирке были опубликованы в другом месте ⁹ исследования воспалительных реакций, связанных с клетками Купфера, подверженных наночастиц. Клетки Купфера также участвуют в патогенезе заболеваний печени, таких как алкогольная болезнь печени, ¹⁰ фиброза печени ¹¹ или вирусного гепатита ^12. Было сообщено, что изолированные клетки Купфера обеспечить полезную информацию для описания клеточных механизмов инвolved к нарушению печени ^13,14.

Несколько методов были зарегистрированы для выделения и очистки клетки Купфера. Изолятор может быть результатом механического или ферментативного разложения ^15. Коллагеназа пищеварения показывает преимущество сохранения функциональной целостности клеток Купфера, в то время как ведущие к высокой доходности купферовских клеток ^16. Многие экспериментальные подходы, различные по сложности и затрат, были использованы, чтобы отделить клетки Купфера от других популяций клеток печени. Например, чистота Купфера клетка может быть достигнуто с помощью иммуноаффинной ^17, электрофорез поток ^18, селективной адгезии ¹⁶ или центробежными методами ^16, которые отбирают клетки в зависимости от их размера и плотности. Сочетание этих методов может быть выбран, чтобы повысить чистоту населения ^16. Там нет консенсуса о идеального метода для выделения клеток Купфера, а это в основном зависит от применения и имеющихся оборудование длят. Тем не менее, в случае испытаний на токсичность наночастиц, простота и высокий выход техники, связанной с сохранением функциональной клетки Купфера оказались наиболее подходящим для этого применения.

Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой ​​перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Этот метод был модифицирован из исходной протоколу, разработанному Smedsrød др. ¹⁶ предназначен для выделения клеток печени крысы. Большинство исследований сообщает и описал изоляции клеток Купфера печени крыс с. При этом мы опишем метод, чтобы изолировать клетки Купфера печени от мыши, с высоким выходом и чистотой. Использование мышей снижает стоимость эксперимента и позволяет обработка нескольких печени, чтобы получить большие количества клеток Купфера для тестирования наночастиц токсичности.

В следующем протоколе, клетки Купфера инкубировали с функционализированных углеродных нанотрубок (е </EM> -CNTs). Уникальные физико-химические свойства УНТ – т.е. высокое отношение длины к диаметру и большой площадью поверхности, сделали УНТ интересных кандидатов в качестве векторов для целей терапии и диагностики. Тем не менее, проблемы были подняты о токсичности УНТ ¹⁹ и разработке новых в пробирке тесты направлена ​​на повышение понимания УНТ биологического эффекта. Токсичность в Клетка Купфера связано с отсутствием структурной целостности клеточных мембран. Этот процесс измеряется потерей цитоплазматического фермента ЛДГ из клетки в супернатанте. Принцип этого метода, таким образом, чтобы удалить любой выпущенный ЛДГ и измерить то, что осталось в клетках ^20. Это делается в предпочтении к измерению выпущенный ЛДГ в супернатанте, так как наличие нанотрубок в надосадочной жидкости мешает анализа ^21.

Мы предлагаем использовать этот простой и экономически эффективной мето изоляции Купфера клеткиd, чтобы изолировать большое количество функциональных клеток Купфера. Это позволяет скрининг токсичности в диапазоне наночастиц, в соответствующей первичной модели макрофагов.