나노 입자 독성 테스트를위한 쿠퍼 세포 격리
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
시험 관내 연구 nanotoxicological 대다수는 실용성 불멸화 세포주를 사용 하였다. 그러나, 불멸화 세포주 또는 일차 전지에 나노 입자 독성 시험의 결과는 시험 관내 분석법 일차 전지의 사용을 확장 할 필요성을 강조 불일치를 보여 주었다. 이 프로토콜은 마우스 간 대 식세포의 분리라는 쿠퍼 세포 및 나노 입자의 독성을 연구하는 사용을 설명합니다. 쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며, 나노 입자 순환 캡쳐 책임 세망 내피 체계 (RES)의 일부를 구성한다. 여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 콜라게나 제 소화 밀도 원심 분리에 기초한 방법은, Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 적응된다. 래트 간세포 isolatio 설계된N과 높은 수율을 제공하며, 쿠퍼 세포의 고순도 (> 95 %) (14 × 10 (6) 마우스 당 세포까지). 이 분리 방법은 복잡한 또는 고가의 장비를 필요로하기 때문에 복잡성과 세포 수율 사이의 이상적인 타협을 대표하지 않습니다. 무거운 마우스 (35-45g)의 사용은 분리 방법의 수율을 현저하게 향상시킬뿐만 아니라, 문맥 삽관의 절차를 용이하게한다. -CNTs F 기능화 된 탄소 나노 튜브의 독성 변성 LDH 분석으로이 모델에서 측정되었다. 이 방법은 F -CNTs 함께 배양 후 쿠퍼 세포막의 구조적 무결성의 부족을 측정함으로써 세포 생존 능력을 평가한다. F -CNTs 의해 유도 된 독성 절연 쿠퍼 세포 나노 독성 시험에 유용한 것을 강조,이 분석을 이용하여 지속적으로 측정 할 수있다. 나노 독성학의 전반적인 이해는 임상 번역 더 effi의 나노 입자 선택을, 같은 모델의 혜택을 누릴 수 있습니다효율적인.
Introduction
나노 독성 연구 분야는 나노 입자의 생물학적 효과의 특성을 목표로한다. 생체 내 연구에 기초한 독성 연구는 가장 정확한 방법이 남아있다. 그러나, 그들의 사용은 자신의 비용, 노동과 시간 요구 사항 (1)에 의해 제한된다. 대안, 시험 관내 분석은 그들의 단순성 및 시험 관내 시험에서 플랫폼이 높은 처리량을 개발의 가능성으로서 사용되고있다 – 그렇게 시험 조건의 수를 확장. 대부분의 nanotoxicological 연구는 불멸화 세포주와 체외 분석에 사용하여 수행됩니다. 그러나, 생체 내 독성 학적 영향 (3)이 실험 결과의 추정에 대한 우려가있다. 실제로, 불멸화 세포주의 특성들이 조직으로부터 유래 된, 예를 들어 유전 적 변형 4 열쇠 형태 적 특징의 열화와 크게 상이 할 수있다5, 6 및 셀룰러 극성 염증성 매개체 (7)의 조정 등의 기능 변화의 손실.
쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며 간 정현파의 벽을 라이닝하여 혈액과 직접 접촉한다. 세망 내피 시스템 (RES)의 일환으로,이 대 식세포는 나노 입자를 순환하기 때문에 캡처에 대한 책임, 나노 입자의 독성을 연구하기 위해 매우 적합 모델을 구성한다. 생체 내 (8) 체외에서 나노 입자에 노출 쿠퍼 세포와 관련된 염증 반응의 9 연구는 다른 곳에서 발표되었다. 쿠퍼 세포는 또한 알콜 성 간 질환 (10), 간 섬유증 (11) 또는 (12)로 바이러스 성 간염, 간 질환의 발병 기전에 관여하고있다. 그것은 절연 쿠퍼 세포가 세포기구 반전을 설명하는 유용한 통찰을 제공 할 것으로 알려졌다간 장애 (13, 14)에 olved.
여러 방법은 분리 및 쿠퍼 세포를 정화하는 것으로보고되었다. 세포 분리는 기계적 또는 효소 분해 (15)에서 발생할 수 있습니다. 콜라게나 제 소화 높은 쿠퍼 세포의 생산량 (16)에 이르는 동안, 쿠퍼 세포의 기능적 완전성을 보존하는 장점을 보여준다. 복잡성과 비용 가변 많은 실험 방법은, 다른 간세포 집단에서 쿠퍼 세포를 분리하는데 사용되어왔다. 예를 들면, 쿠퍼 세포 면역 순도 17 전기 흐름 (18) (16)에 의해 선택적으로 부착 또는 크기와 밀도에 따라 세포를 원심 선택 기법 (16)에 의해 달성 될 수있다. 이들 방법의 조합이 인구 (16)의 순도를 증가시키기 위해 선택 될 수있다. 그것은 대부분의 응용 프로그램 및 사용 가능한 기술 장비에 따라 달라집니다로 쿠퍼 세포 분리를위한 이상적인 방법에 대한 합의는 없다T. 그러나, 나노 입자의 독성 시험의 경우에는, 단순 및 쿠퍼 세포의 보존 기능과 관련된 기술의 높은 수율이 애플리케이션에 가장 적합한 것으로 나타났다.
여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 방법은 Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 변성시켰다. 16 래트 간세포 분리 설계된. 대부분의 연구는보고 된 쥐의 간에서 쿠퍼 세포의 분리를 설명. 여기서, 우리는 높은 수율 및 순도, 마우스 간에서 쿠퍼 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 마우스의 사용은 실험 비용을 감소시키고, 간 몇몇의 처리는 나노 입자에 대한 독성 시험 쿠퍼 세포 다량 수득 할 수있다.
다음의 프로토콜에서, 쿠퍼 세포 (F 기능화 된 탄소 나노 튜브와 함께 배양 하였다 </EM> -CNTs). 탄소 나노 튜브의 고유의 물리 화학적 특성 – 치료 및 진단 목적을위한 벡터로서 CNT를 흥미 후보 만든, 직경 비 표면적이 높은 길이 즉. 그러나, 문제는 탄소 나노 튜브 (19)의 독성 및 시험 관내 시험에서의 새로운 개발 CNT 생물학적 효과의 이해를 증가시키는 것을 목적 관한 제기되었다. 쿠퍼 세포 독성은 세포막의 구조적 무결성의 부족과 관련된다. 이것은 상등액으로 세포로부터 세포질 효소 LDH의 손실에 의해 측정된다. 이 방법의 원리에 따라서, 어떤 공개 LDH를 제거하고, 세포 (20)에 남아 있는지를 측정하는 것이다. 상등액 중 탄소 나노 튜브의 존재는 21 분석법을 방해하기 때문 상청 LDH 방출의 측정에 우선하여 수행된다.
우리는이 간단하고 비용 효과적인 쿠퍼 세포 분리 운전 방식의 사용을 제안D는 기능 쿠퍼 세포의 높은 숫자를 분리합니다. 이는 관련 차 대식 세포 모델에서, 나노 입자의 범위의 독성 검사를 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음 단계는 높은 수율 및 쿠퍼 세포의 높은 가능성을 달성하기 위해 중요하다. 무균 조건은 세균 및 진균의 오염의 위험을 제한하기 위해 사용되어야한다. 모든 장비는 사용하기 전에 소독해야합니다. 시약 갓 분리 절차를 수행하기 전에 준비를해야합니다.
콜라게나 제 IV의 선택은 낮은 트립신 활성, 결정적이다. 동일한 공급자로부터 다른 많은 다른 효소 활성을 가지고 있…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
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