Burada bir protokol, önceden enfekte edilmiş dendritik hücreler (DC) transinfection ile antijen sunumu sırasında ortaya çıkan, CD4 + T hücreleri tarafından bakteriyel yakalama ölçmek için sunulmuştur. Birincil hücreler, DC, DC / T hücre konjuge oluşumu enfeksiyon ve bakteri T hücre transfeksiyon ölçüm izolasyon: Biz gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Bir patojen konukçu bulaştığında, genellikle bakteriyel temizlenmesi için gerekli olan doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin, bir aktivasyon vardır. Doğuştan gelen bağışıklık çoğu enfeksiyonları önler ilk savunma hattıdır. Doğuştan gelen bağışıklık mikroorganizma ana gruba arasında korunan bir hassas bir şekilde elemanları (patojenle ilişkili molekül örnekleri, PAMPS) 1 ayırt. Doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları fagositler (makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler), mast hücreleri, eozinofiller, bazofiller ve doğal öldürücü hücreleri içerir, fiziksel deri gibi engelleri, kimyasal bariyerler (antimikrobiyal peptitler, lizozim) ile doğuştan gelen lökositler arasında, 2. Bu hücreler temas yoluyla veya patojenin içine çeken ve öldürme içeren fagositoz yoluyla onlara saldırarak ya tanımlamak ve patojenleri ortadan kaldırır. Bu sistem, p karşı bağışıklık belleğini kazandıran adaptif bağışıklık aksine, yaşam boyu savunma izin vermezathogens. Adaptif bağışıklık sistemi savunma İkinci satır ve tanımak ve birden mikrobik olmayan mikrobiyal maddelerin 3 spesifik antijenlere tepki yapabiliyor. Adaptif immün sisteminin ana bileşenleri B ve T hücrelerini içerir lenfositlerdir. B hücreleri, patojenler veya dışsal proteinlere karşı antikorlar salgılayan, hümoral yanıt olarak dahil edilmektedir. Bununla birlikte, T hücreleri sitokin sekresyon veya öldürme patojen ile enfekte olmuş hücrelerde 4 bağışıklık tepkisini modüle hücre aracılı bağışıklık temsil etmektedir.
Büyük histo uyumlu kompleks (MHC) 5-7 hücre yüzeyinde sunulur antijenler içine fagosite ederler patojenler ve işlem bakteriyel bileşenler tanıyabilir dendritik hücreler ya da makrofajlar, doğal bağışıklık sisteminin bir parçası, aşağıdakileri içeren Antijen sağlayan hücreler (APC 'ler). APC 'ler patojenleri fagosite sonra, bunlar genellikle T etkileşime boşaltma lenf düğümlerine göçHücreler. T lenfositleri, T hücre reseptörleri tarafından spesifik peptit-MHC kompleksleri tanıyabilir. Bağışıklık sinaps (IS) antijen sunumu 8,9 sırasında antijen yüklü APC ve lenfosit arasındaki ara yüzeyde oluşur. Bazı bakteriler fagositozu hayatta ve APC 'içinde sistematik olarak yaymak olabilir. Bu görüşe göre, enfekte ZPT bakteriyel rezervuar veya bakteriyel yayılmasını kolaylaştıran 10 "Truva atları" olarak hizmet vermektedir. APC 've BS oluşumu sırasında gerçekleşecek lenfositler arasındaki yakın temas, aynı zamanda membranların, genetik materyalin ve eksozom parçası alışverişi için bir platform olarak işlev ve T hücreleri enfekte bazı virüsler için kaçırdılar olabilir; bu işlem 11-13 transinfection olarak adlandırılır.
Bazı patojen bakterilerin (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica ve Shigella flexneri) in vivo T lenfositleri istila ve davranışlarını 14-16 değiştirmek edebiliyoruz. SahibizSon zamanlarda T lenfositleri de antijen sunumu 16 sırasında önceden enfekte dendritik hücreler (DC) dan transinfection bakterilerin yakalamak mümkün olduğunu anlattı. T hücresi doğrudan enfeksiyonlara daha (1,000-4,000x) derece daha etkili transinfection bakteri yakalama. Transinfection daha gösteren T hücreleri yakalama patojen olmayan patojen bakteriler T hücreleri tarafından tahrik edilen bir işlemdir. Çarpıcı, hücreler hızla yakalanan bakterileri öldüren ve profesyonel fagositler 16 daha çok fazla verimli yaptım T (TİT) transinfected. Immünoloji bir dogmayı kırmak Bu sonuçlar, adaptif bağışıklık hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sözde münhasır olan işlevleri yerine göstermektedir. Buna ek olarak, meme ucu hücreleri pro-enflamatuar sitokinlerin büyük miktarlarda salgılarlar ve in vivo bakteriyel enfeksiyonlara karşı koruma gösterdi.
Burada bakteriyel transinfection sürecini incelemek için kullanılan farklı protokoller sunmakFare modeli. Bu model, bakteri bulaşmış kemik ile spesifik olarak etkileşime I-Ab 17 bağlamında OVA (OVAp) peptit 323-339 için TCR spesifik taşıyan transgenik farelerin OTII, CD4 + T hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır iliği stabil bağışıklık sinaps meydana OVAp yüklü DH'ler türetilmiş (BMDCs) 18,19.
T hücre transinfection görüntülendi ve floresan mikroskobu kullanarak izlenebilir. Buna ek olarak, akış sitometrisi, yeşil floresan proteini (GFP) 16,20 ifade bakteriler tarafından yayılan floresan yararlanarak tarafından enfekte edilen hücreleri tespit edilmesi için de kullanılabilir. Ayrıca, T hücresi transinfection daha hassas bir yaklaşım, etkinlikleri sayıda ölçümünü sağlar gentamisin sağkalım analizi ile tayin edilebilir. Gentamisin ökaryotik hücreleri içine giremeyeceği bir antibiyotiktir. Bu nedenle, bu antibiyotiği kullanarak antibiyotik ilave fr hayatta hücre içi bakteri farklılaşmasını veriyor21 öldürüldüğü om dışı olanlar.
T hücreleri veya T lenfositleri adaptif bağışıklık yanıtı 26 hücre-aracılı bağışıklığın bir rol oynayabilir ve ait lökosit türüdür. T hücreleri in vitro enfekte olma dirençli ama bazı raporlar, in vivo 14,15 enfekte olabilir göstermektedir. Bağışıklık sinaps sırasında APC ve T hücrelerinin samimi kişiler HIV gibi bazı virüsler 11 de dahil olmak üzere biyolojik madde 13, alışverişi için platformlar olarak hizm…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
2-ME | Gibco | 31350-010 | |
OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
Transwell | Costar | 3415 | |
LB | Pronadisa | 1231 | |
Agar | Pronadisa | 1800 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | |||
CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
BSA | SIGMA | A7030-100G | |
Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |