Summary

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Published: January 13, 2016
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Summary

ここで、プロトコルは、事前に感染した樹状細胞(DC)からtransinfection介して抗原提示の間に発生するCD4 + T細胞による細菌の取り込みを測定するために提示されています。初代細胞、DC、DC / T細胞複合体の形成の感染、および細菌のT細胞トランスフェクションの測定の分離:私たちは、必要なステップを実行する方法を示しています。

Abstract

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Introduction

病原体は、ホストに感染すると、細菌排除のために必要な自然免疫と適応免疫応答の活性化は、通常はあります。自然免疫は、ほとんどの感染を防ぐ防御の最前線です。自然免疫は、微生物の広範なグループの間で保存されている正確な方法要素(病原体関連分子パターン、PAMPS)1に区別します。先天性免疫機構は、食細胞(マクロファージ、好中球、および樹状細胞)、マスト細胞、好酸球、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞を含む皮膚、化学障壁(抗菌ペプチド、リゾチーム)と先天的白血球、などの物理的障壁を含みます2。これらの細胞は、コンタクトを介して、または病原体巻き込むと殺害を含んで食作用を介してそれらを攻撃することによってのいずれか、特定して病原体を排除します。このシステムは、pに対する免疫記憶を与える適応免疫とは対照的に、生涯の防衛を許可していませんathogens。適応免疫系は、防衛の2行目で、認識し、複数の微生物および非微生物物質3の特定の抗原に反応することができます。適応免疫系の主要な構成要素は、BおよびT細胞を含むリンパ球です。 B細胞は、病原体または外来性タンパク質に対する抗体を分泌する、体液性応答に関与しています。しかし、T細胞は、サイトカイン分泌または殺す病原体に感染した細胞を4との免疫応答を調節する、細胞性免疫を表します。

主要組織適合複合体(MHC)5-7によって細胞表面に提示される抗原に貪食病原体及びプロセス細菌成分を認識することができ、樹状細胞またはマクロファージ、先天性免疫系の構成成分を含む、抗原提示細胞(APC)。 APCが病原体を貪食した後、彼らは通常、彼らはTと対話流入領域リンパ節への移行します細胞。 Tリンパ球は、そのT細胞レセプターによって特異的ペプチド-MHC複合体を認識することができます。免疫シナプス(IS)は、抗原提示8,9の間に抗原負荷APCとリンパ球との界面に発生します。いくつかの細菌は、食作用を生き残るためには、APCの内部に体系的に普及させることができます。このビューでは、感染したAPCは、細菌の貯水池や細菌の拡散10を容易に 「トロイの木馬」としての役割を果たす。 IS形成の過程で起こりAPCおよびリンパ球の間の密接な接触はまた、膜の一部の交換、遺伝物質およびエキソソームのためのプラットフォームとして機能し、T細胞を感染させるためにいくつかのウイルスのハイジャックすることができます。このプロセスはtransinfection 11-13と呼ばれています。

いくつかの病原性細菌( リステリア菌サルモネラ菌赤痢菌)は 、in vivoでのTリンパ球に侵入し、その挙動14-16を変更することができます。我々は持っています最近、Tリンパ球は、抗原提示16の過程で以前に感染した樹状細胞(DC)からtransinfectionによって細菌を捕捉することができることを説明しました。 T細胞の直接感染より(1,000-4,000x)極めてより効果transinfectionによる細菌捕獲。 T細胞はtransinfectionはT細胞によって駆動されるプロセスよりも示す病原体及び非病原体細菌を捕捉します。驚くべきことに、細胞が急速に捕捉された細菌を殺し、プロの食細胞16よりもので、より効率的にやったT(東工大)transinfected。免疫学の定説を破るこれらの結果は、適応免疫の細胞は、先天性免疫のおそらく排他的であった機能を実行することができることを示しています。加えて、我々は、TIT細胞が前炎症性サイトカインを大量に分泌し、 インビボでの細菌感染から保護することが示されました。

ここでは、細菌transinfectionプロセスを研究するために使用される様々なプロトコルを提示マウスモデル。このモデルは、細菌に感染した骨と特異的に相互作用するI-AB 17の文脈においてOVA(OVAp)ペプチド323-339に特異的なTCRを負担OTIIトランスジェニックマウスからのCD4 + T細胞の使用に基づきますmarrow-安定した免疫シナプスを形成OVApでロード由来DC(BMDCを)18,19、。

T細胞transinfectionを可視化し、蛍光顕微鏡を使用して追跡することができます。さらに、フローサイトメトリー、緑色蛍光タンパク質(GFP)16,20を発現する細菌によって放出される蛍光を利用して、感染した細胞を検出するために使用することができます。さらに、T細胞transinfectionより敏感なアプローチ、多数のイベントの測定を可能にゲンタマイシン生存アッセイにより定量することができます。ゲンタマイシンは、真核細胞に浸透することができない抗生物質です。したがって、この抗生物質を使用して、抗生物質添加FRを生き残った細胞内細菌の分化を可能にします21を殺されたオム外のもの。

Protocol

注意:実験手順は、大学自治・デ・マドリッドの研究倫理委員会によって承認され、スペイン語、欧州のガイドラインに従って動物福祉と健康の大学自治・デ・マドリードヘッドの監督の下で行われました。マウスは、特定病原体不在(SPF)は、ハウジングで飼育され、それらは、二酸化炭素(CO 2)吸入法を用いて、訓練を受けた有資格者により安楽死させました。 <p class="jove_ti…

Representative Results

ここで、我々は派生-DCを感染した骨髄からマウスT細胞細菌transinfectionを実行する方法を説明し、どのように2つの異なるアプローチを介した細菌transinfectionを測定する:フローサイトメトリーおよびゲンタマイシン生存アッセイ図1は、細胞を得るための手順をまとめたものです。 DCは、9日間のGM-CSFとの骨髄細胞をインキュベートすることによって生成され…

Discussion

T細胞またはTリンパ球は細胞性免疫において中心的な役割を果たし、適応免疫応答26に属している白血球の一種です。 T細胞 、インビトロで感染されるのに不応性であるが、いくつかの報告は、それらインビボ14,15 感染させることができることを示しています。免疫シナプス中のAPCとT細胞の緊密な連絡先は、HIV 11のようないくつかの?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Materials

RPMI Fisher Scientific SH3025501
r-GMCSF Peprotech 315-03
LPS SIGMA L2630-10mg
Na Pyruvate Thermo Scientific SH3023901
2-ME Gibco 31350-010
OVAp OTII (323–339) GenScript
Cell Strainer 70uM BD 352350
 30uM Syringe Filcons Sterile BD 340598
AutoMacs Classic Miltenyi Biotec 130-088-887
Gentamicin Normon 624601.6
Transwell Costar 3415
LB Pronadisa 1231
Agar Pronadisa 1800
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100
CD8 biot BD Biosciences 553029
IgM Biot ImmunoStep Clone RMM-1
B220 Biot BD Biosciences 553086
CD19 biot BD Biosciences 553784
MHC-II Biot (I-A/I-E) BD Biosciences 553622
CD11b biot Immunostep 11BB-01mg
CD11c biot Immunostep 11CB3-01mg
DX5 biot BD Biosciences 553856
Gr-1 biot BD Biosciences 553125
CD16/CD32 ImmunoStep M16PU-05MG
anti Salmonella ABD Serotec 8209-4006
CD11cPE BD Biosciences 553802
CD4-APC Tonbo Biosciences 20-0041-U100
Gr-1 APC BD Biosciences 553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC BD Biosciences 553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Invitrogen A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) Life technologies C2110
BSA SIGMA A7030-100G
Streptavidin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-101
BD FACSCanto II BD Biosciences

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Cruz-Adalia, A., Ramírez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacón, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (107), e52976, doi:10.3791/52976 (2016).

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