Summary

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Published: January 13, 2016
doi:

Summary

Aqui é apresentado um protocolo para medir a captura de bactérias por células T CD4 +, o qual ocorre durante a apresentação de antigénio através de células dendríticas transinfection pré-infectadas (DC). Mostramos como executar os passos necessários: isolamento de células primárias, infecção de formação conjugado celular DC, DC / T, e medição da transfecção de células T bacteriana.

Abstract

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Introduction

Quando um agente patogénico infecta o seu hospedeiro, geralmente há uma ativação da resposta imune inata e adaptativa, necessários para o apuramento bacteriana. A imunidade inata é a primeira linha de defesa que impede a maioria das infecções. A imunidade inata em distinguir a maneira como os elementos precisos que são conservadas entre grandes grupos de microrganismos (padrões moleculares associados a agentes patogénicos, PAMPS 1). Os mecanismos da imunidade inata incluem barreiras físicas tais como a pele, as barreiras químicas (péptidos antimicrobianos, lisozima) e os leucócitos inatos, que incluem os fagócitos (macrófagos, neutrófilos, e células dendríticas), mastócitos, eosinófilos, basófilos e células assassinas naturais 2. Estas células identificar e eliminar patógenos, quer por atacá-los através do contato ou via fagocitose, que inclui patógeno engolindo e matando. Este sistema não permite a defesa ao longo da vida, em contraste com a imunidade adaptativa, que conferem memória imunológica contra pathogens. O sistema imune adaptativo é a segunda linha de defesa e é capaz de reconhecer e de reagir a antigénios específicos de múltiplos microbiana e substâncias não-microbianos 3. Os principais componentes do sistema imunitário adaptativo são linfócitos, que incluem células B e T. As células B estão envolvidos na resposta humoral, que segregam anticorpos contra os agentes patogénicos ou proteínas exógenos. No entanto, as células T representar a imunidade mediada por células, modulando a resposta imunitária com citocinas secreção ou matando as células infectadas com agentes patogénicos 4.

Células apresentadoras de antígenos (APCs) incluindo os macrófagos ou células dendríticas, dos componentes do sistema imune inato, pode reconhecer patogénios fagocitam e processos componentes bacterianos em antigénios, que são apresentados na superfície da célula pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de 5-7. Depois de APCs foram fagocitados patogénios, eles usualmente migram para os gânglios linfáticos de drenagem, onde eles interagem com Tcélulas. Os linfócitos T podem reconhecer complexos MHC-péptido específicos pelos seus receptores de células T. A sinapse imune (IS) ocorre na interface entre uma APC carregadas com antigénio e um linfócito durante a apresentação do antigénio 8,9. Algumas bactérias podem sobreviver fagocitose e divulgar sistematicamente dentro APCs. Nesta visão, APCs infectados servem como reservatórios de bactérias ou "cavalos de tróia" que facilitam a propagação de bactérias 10. O contato íntimo entre APCs e os linfócitos que ocorrem durante o curso de formação é também funcionar como uma plataforma para a troca de parte das membranas, material genético e exossomos e pode ser sequestrado por alguns vírus para infectar células T; este processo é chamado transinfection 11-13.

Algumas bactérias patogénicas (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica e Shigella flexneri) são capazes de invadir os linfócitos T in vivo e alterar o seu comportamento 14-16. Nós temosdescrito recentemente que os linfócitos T também são capazes de capturar as bactérias por transinfection a partir de células dendríticas infectadas anteriormente (DCs) durante o curso de apresentação de antigénio 16. T célula bacteriana captura por transinfection muito mais eficaz (1,000-4,000x) do que infecções diretos. T patógeno células captura e bactérias não-patógeno indicando que transinfection é um processo impulsionado por células T. Surpreendentemente, transinfected T (TIT) células mortas rapidamente as bactérias capturados e fê-lo de forma mais eficiente do que os fagócitos profissionais 16. Estes resultados, que quebram um dogma de imunologia, mostram que as células de imunidade adaptativa pode executar funções que foram supostamente exclusiva da imunidade inata. Além disso, mostrámos que as células tit secretar grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias e proteger de infecções bacterianas in vivo.

Aqui apresentamos os diferentes protocolos utilizados para estudar o processo transinfection bacteriana emum modelo de rato. Este modelo baseia-se na utilização de células T CD4 + a partir de ratinhos transgénicos OTII, que carregam um TCR específico para o péptido 323-339 de OVA (OVAp) no contexto de I-Ab 17 que interagem especificamente com o osso bacteriana infectada marrow- DCs derivadas BMDCs (18,19) carregados com OVAp, que formam sinapses imunes estáveis.

T transinfection célula pode ser visualizado e rastreados utilizando microscopia de fluorescência. Além disso, a citometria de fluxo pode ser usado para a detecção de células infectadas por aproveitando a fluorescência emitida por bactérias que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) 16,20. Além disso, T transinfection célula pode ser quantificada por um método mais sensível, a gentamicina ensaio de sobrevivência que permite a medição de um grande número de eventos. A gentamicina é um antibiótico que não podem penetrar nas células eucarióticas. Portanto, utilizando este antibiótico permite a diferenciação de bactérias intracelulares que sobreviveram à adição de antibiótico FRos extracelulares om que foram mortas 21.

Protocol

Nota: Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidad Autónoma de Madrid e conduzido sob a supervisão da Universidad Autónoma de Madrid Cabeça de Bem-Estar Animal e Saúde de acordo com diretrizes espanholas e europeias. Os camundongos foram criados em free (SPF) de habitação específico patógeno e eles foram sacrificados por pessoal treinado e qualificado, utilizando dióxido de carbono (CO 2) método de inalação. 1. Rato Me…

Representative Results

Aqui descrevemos como executar transinfection bacteriana de células T de murino a partir de medula óssea derivadas de DCs infectadas e como medir transinfection bacteriana através de duas abordagens diferentes: a citometria de fluxo e ensaio de sobrevivência gentamicina A Figura 1 resume o procedimento para obter as células.. DCs são geradas por incubação de células de medula óssea com GM-CSF durante 9 dias. Em seguida, as DCs são maturados com LPS para aument…

Discussion

As células T ou linfócitos T são um tipo de leucócitos que desempenham um papel central na imunidade mediada por células e pertencem a resposta imune adaptativa 26. As células T são refractários à infecção in vitro, mas alguns relatórios indicam que eles podem ser infectadas in vivo 14,15. Os contatos íntimos de células T e APC durante sinapse imune servir de plataforma para o intercâmbio de material biológico 13, incluindo alguns vírus, como o HIV <sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Materials

RPMI Fisher Scientific SH3025501
r-GMCSF Peprotech 315-03
LPS SIGMA L2630-10mg
Na Pyruvate Thermo Scientific SH3023901
2-ME Gibco 31350-010
OVAp OTII (323–339) GenScript
Cell Strainer 70uM BD 352350
 30uM Syringe Filcons Sterile BD 340598
AutoMacs Classic Miltenyi Biotec 130-088-887
Gentamicin Normon 624601.6
Transwell Costar 3415
LB Pronadisa 1231
Agar Pronadisa 1800
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100
CD8 biot BD Biosciences 553029
IgM Biot ImmunoStep Clone RMM-1
B220 Biot BD Biosciences 553086
CD19 biot BD Biosciences 553784
MHC-II Biot (I-A/I-E) BD Biosciences 553622
CD11b biot Immunostep 11BB-01mg
CD11c biot Immunostep 11CB3-01mg
DX5 biot BD Biosciences 553856
Gr-1 biot BD Biosciences 553125
CD16/CD32 ImmunoStep M16PU-05MG
anti Salmonella ABD Serotec 8209-4006
CD11cPE BD Biosciences 553802
CD4-APC Tonbo Biosciences 20-0041-U100
Gr-1 APC BD Biosciences 553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC BD Biosciences 553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Invitrogen A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) Life technologies C2110
BSA SIGMA A7030-100G
Streptavidin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-101
BD FACSCanto II BD Biosciences

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Cruz-Adalia, A., Ramírez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacón, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (107), e52976, doi:10.3791/52976 (2016).

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