Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.
Neutrofiler, den vanligast förekommande av samtliga vita blodkroppar i den humana cirkulationen, spelar en viktig roll i värdförsvar mot invaderande mikroorganismer. Dessutom neutrofiler spelar en central roll i immunövervakning av tumörceller. De har förmågan att känna igen tumörceller och inducera tumörcelldöd antingen genom en cellkontaktberoende mekanism som innefattar väteperoxid eller genom antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumöraktivitet kan isoleras från perifert blod av cancerpatienter och hos tumörbärande möss. Dessa neutrofiler kallas tumörburna neutrofiler (TEN) för att skilja dem från neutrofiler av friska försökspersoner eller naiva möss som inte visar någon signifikant tumörcytotoxisk aktivitet. Jämfört med andra vita blodkroppar, neutrofiler visar olika flytkraft som gör det möjligt att erhålla en> 98% ren neutrofila populationen när det utsätts för en densitetsgradient. Men förutomden normala hög densitet neutrofila populationen (HDN), i cancerpatienter, i tumörbärande möss, samt under kroniska inflammatoriska tillstånd, olika låg densitet neutrofila populationer (LDN) återfinns i cirkulationen. LDN samrenas med den mononukleära fraktionen och kan separeras från mononukleära celler genom att använda antingen positiva eller negativa strategier för urvalet. När renheten hos de isolerade neutrofiler bestäms genom flödescytometri, kan de användas för in vitro-och in vivo-funktionella analyser. Vi beskriver metoder för övervakning av antitumöraktivitet av neutrofiler, deras förmåga att migrera och att producera reaktiva syreradikaler, samt att övervaka deras fagocytisk kapacitet ex vivo. Vi beskriver ytterligare metoder för att märka neutrofiler för in vivo-spårning, och för att bestämma deras anti-metastatiska kapacitet in vivo. Alla dessa tekniker är nödvändiga för att förstå hur du skaffar och karakterisera neutrofiler med antitumörfunktion.
Neutrofiler ursprungligen karakteriserades som det medfödda immunceller, vilka fungerar som första linjens försvar mot invaderande mikroorganismer. Idag är det känt att neutrofiler har mer långtgående funktioner, vara delaktiga i montering adaptiva immunsvar mot främmande antigener 1,2, som reglerar blodbildningen 3, angiogenes 4 och sårläknings 5. Dessutom kan neutrofiler påverka tumörtillväxt och metastasutvecklingen i kraft av deras pro- och anti-tumöraktiviteter 6,7. Neutrofiler kännetecknas av en polymorf segmenterad kärna (därav kallas polymorfonukleära (PMN) leukocyter) och innehåller åtminstone tre distinkta underklasser av granulat samt sekretoriska vesiklar 8 (Figur 1A-C).
Neutrofiler har hög fagocytisk kapacitet och hög NADPH-oxidasaktivitet kritisk för mikrobiell eliminering, och utsöndrar ett brett spektrum av kemokiner som är viktiga för pådragning av ytterligare neutrofiler och andra immunceller till platsen för inflammation 8,9. Neutrofiler kännetecknas av uttrycket av en stor mängd av ytreceptorer inklusive Toll-liknande receptorer (TLRs), C-typ Lectin Receptorer (CLR), komplementreceptor 3 (CD11b / CD18) och andra adhesionsmolekyler (t.ex., L-selektin, LFA-1, VLA-4 och karcinoembryoantigen relaterade celladhesionsmolekyl 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (t.ex. CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemoattraherande receptorer (t.ex. PAFR, LTB4 R och C5AR) , cytokinreceptorer (t.ex. G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptidreceptorer (t.ex. FPR1-3) och Fc-receptorer (t ex CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) och CD64 (FcyRI) 10. Hos möss är neutrofiler vanligen identifieras som CD11b + Ly6G +, medan humana neutrofiler identifieras med hjälp av CD11b, CD15, CD16 och CD66b leukocyter markörer. Det är också allmänt accepterat att färga för granulproteiner myeloperoxidas (MPO) och neutrofilelastas (NE) för detektering av neutrofiler i vävnader.
Det är fortfarande oklart om de olika funktionerna hos neutrofiler förmedlas av samma cell eller olika cellunderpopulationer. Ackumulerande data tyder på närvaron av en heterogen neutrofil population som uppvisar en hög grad av plasticitet som påverkas av pro-inflammatoriska stimuli och mikromiljön 11,12. Fridlender et al. 13 har grovt delas neutrofilerna i cancer i två stora delpopulationer kallas N1 med anti-tumöregenskaper och N2 med pro-tumöregenskaper. I cancer, såväl som vid kronisk inflammation, finns det ytterligare en subpopulation sammansatt av granulocytiska myeloida härledda suppressorceller (G-MDSCs) som undertrycker T-cellsvar 14. G-MDSCs anses vara omogna myeloidceller som kännetecknas av en CD11b + Ly6Clåg Ly6G hej fenotyp i möss 15, samtidigt som en CD15 + / CD16 låg fenotyp i mänsklig 16. G-MDSCs uttrycka högre nivåer av arginas och myeloperoxidas, medan lägre nivåer av cytokiner och kemokiner än normalt cirkulerande neutrofiler. De är mindre fagocytiska och flyttande, men ger högre nivåer av ROS 15,17,18. I föreliggande dokument kommer vi att beskriva några grundläggande metoder för isolering och karakterisering av neutrofiler med antitumöregenskaper.
Medan neutrofiler utgör den största befolkningen av alla vita blodkroppar i den mänskliga cirkulationen (45 – 70%, 1800 – 6000 / l), hos möss, under normala förhållanden, de är ganska glesa (10 – 15%, från 300 till 500 / il ). Neutrofilantalet ökar stadigt vid inflammation och ibland i cancer, som representerar ett tillstånd av kronisk inflammation 7. Neutrofiler utvecklas från multi gemensam myeloid föregångare (CMP) cells i benmärgen, genom en differentieringsprocess som passerar de olika stadierna i myeloblaster (MB), promyelocyter (PM), myelocyter (MC), metamyelocyter (MM) och bandceller (BC) 8. De mogna, efter mitotiska neutrofiler kan förbli i benmärgen 4 – 7 dagar innan de släpps till cirkulationen 8. Neutrofil omsättning i blodet är vanligtvis snabb med en genomsnittlig halveringstid på 6 – 12 timmar, som kan förlängas i enlighet med inflammatoriska tillstånd. Ostimulerade neutrofiler har begränsad anti-tumörframkallande aktivitet, en funktion som kan förvärvas genom att exponera de naiva neutrofiler till kemokinerna IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 och CXCL5 6,19 eller artificiellt, genom att utsätta dem för forbolestem forbol 12 -myristate 13-acetat (PMA) 6.
Den korta halveringstiden för blodneutrofiler tillsammans med det låga antalet neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) uppnås från en ml blod från en naiv 6-8 veckor gammal mus, har gjort detsvårt att utforska funktionen av cirkulerande mus neutrofiler in vitro. För att övervinna denna svårighet har andra källor använts. Exempelvis kan ett stort antal neutrofiler erhållas från benmärg 20 eller bukhinnan efter induktionen av steril inflammation (t.ex., efter intraperitoneal injektion av tioglykolat buljong eller Zymosan A). Det bör noteras att neutrofiler erhållna från peritonealhålan inte utövar något antitumörframkallande aktivitet (opublicerad observation).
Et al. Granot 6 observerat att BALB / c-möss ympades ortotopiskt med musen 4T1 bröstkarcinom cellinjen utveckla neutrofili vilket förvärrar med tumörprogression 6 (figur 2A), så att 20 till 40.000.000 blodneutrofiler kan lätt isoleras från en ml blod 3-4 veckor efter tumörinokulering. Dessa neutrofiler har förvärvat anti-tumöraktiviteter, och har därför varit coibestämda tumörburna neutrofiler (TEN), i syfte att skilja dem från naiva neutrofiler 6 (Figur 2B). Medan hög densitet neutrofiler (HDN, Figur 1A) är starkt antitumörframkallande, låg densitet neutrofiler (LDN, Figur 1B) som genereras i samband med cancer är inte 21. Även hög densitet neutrofiler från benmärgen och mjälten hos tumörbärande möss har anti-tumöraktivitet (opublicerade data). Det bör noteras att med tumörprogression mjälten blir gradvis förstorad (splenomegali), med ökande mängder neutrofiler.
Det bör noteras att TEN genereras också i andra modeller av cancer inklusive både spontana (MMTV-pymt och MMTV-Wnt1 brösttumörer och K-Ras-drivna lungtumörer) och injicerades (AT-3 (MMTV-pymt) och E0771 bröstkarcinom celler, LLC Lewis lungkarcinomceller och B16-F10-melanomceller). Men omfattningen av neutrofila mobilisering i dessa tumeller modeller är betydligt mindre än i 4T1-ympade möss, når 5 – 10 x 10 6 neutrofiler i 1 ml blod efter 3 veckor.
Neutrofiler är den vanligast förekommande av alla vita blodkroppar och är de första responders i fall av infektion och inflammation. Som sådana är de mycket känsliga för yttre signaler och är lätt aktiveras. Dessutom neutrofiler har en mycket kort halveringstid och en snabb omsättning. Tillsammans utgör dessa egenskaper upp flera svårigheter att arbeta med neutrofiler, så att unika experimentella strategier krävs. Till exempel finns det flera neutrofila strategier renings, alla med sina egna fördelar och…
The authors have nothing to disclose.
ZG stöds av bidrag från I-CORE-programmet i Israel Science Foundation (Grant nr 41/11), den Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Israel Cancer Research Foundation (ICRF – Forskning Career Development Award) och ORO stiftelse. ZGF stöds av bidrag från Israel Cancer Research Foundation (ICRF – Forskning Career Development Award), chefsforskare i Israel hälsoministeriet och Israel Lung Association.
CELL LINES | |||
Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
20G 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
23G 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
25Gx5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
POWDER | |||
Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
Penicillin Streptomycin x1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
SOLUTIONS | |||
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
PBS+0.5% BSA | Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
PBS+1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
KITS | |||
EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
ANTIBODIES | |||
FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |