抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

好中球は、最初に侵入微生物に対する最初の行の防御として機能する自然免疫細胞として特徴づけられました。今日では、好中球は造血^3の調節、外来抗原^1,2-に対する適応免疫応答をマウントに関与している多くの広範囲の機能を有することが知られている血管新生^4,5創傷治癒します。さらに、好中球は、それらのプロ及び抗腫瘍活性^6,7によって腫瘍の増殖および転移の進行に影響を及ぼし得ます。好中球は、多型、セグメント化、核によって特徴付けられる（したがって、多形核（PMN）白血球と呼ばれる）と、少なくとも3顆粒の別個のサブクラスならびに分泌小胞^8（ 図1A-C）を含有します。

好中球は、高い貪食能と微生物の除去のための重要な高NADPHオキシダーゼ活性を有しており、時のための重要なケモカインの広い範囲を分泌します炎症^8,9の部位に付加的な好中球および他の免疫細胞の牽引。好中球は、Toll様受容体（TLR）を含む表面受容体の多量の発現を特徴とする、C型レクチン受容体（のCLR）は、受容体3（のCD11b / CD18）、および他の接着分子（ 例えば、L-セレクチンを補完しますLFA-1、VLA-4および癌胎児性抗原関連細胞接着分子3（CEACAM3 / CD66b））、ケモカイン受容体（ 例えば、CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、化学誘引物質受容体（ 例えば、PAFR、LTB ₄ RとのC5aR） 、サイトカイン受容体（ 例えば、G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、ホルミルペプチド受容体（ 例えば、FPR1-3）、およびFc受容体（ 例えば、CD16（FcγRIIIをヒト好中球はのCD11b、CD15、CD16およびCD66b白血球マーカーを用いて同定されるのに対して）、CD32（のFcγRII）およびCD64（FcγRIで^）10。マウスでは、好中球は通常、のCD11b ⁺ Ly6G ⁺として同定されています。また、一般的に組織中の好中球の検出のための顆粒タンパク質のミエロペルオキシダーゼ（MPO）と好中球エラスターゼ（NE）のために染色する受け入れられています。

これは、好中球の多様な機能が同じ細胞により、または異なる細胞亜集団によって媒介されるかどうかはまだ不明です。蓄積データは、プロ炎症性刺激と微小環境^11,12の影響を受けて可塑性の高度を示す異種好中球集団の存在を示唆しています。 Fridlender ら ^13は、2つの主要な亜集団に癌において好中球を著しく分割しているプロ腫瘍特性を有する抗腫瘍特性を有するN1およびN2と呼ばれます。癌において、ならびに慢性炎症において、T細胞応答^14を抑制顆粒骨髄由来サプレッサー細胞（G-たMDSC）からなる追加の亜集団が存在します。 G-のMDSCはのCD11b ⁺ Ly6Cによって特徴付け未熟骨髄細胞であると考えられていますマウス¹⁵で^低 Ly6G ^{こんにちは}表現型、ヒト¹⁶でCD15 ⁺ / CD16 ^低の表現型を有しながら。 G-たMDSC通常よりもサイトカインおよびケモカインのより低いレベルは、好中球を循環させながら、アルギナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのより高いレベルを発現します。彼らはあまり食作用および移動であるが、ROS ^15,17,18の高いレベルを生成します。本論文では、抗腫瘍特性を有する好中球の単離および特徴付けのためにいくつかの基本的な方法論を説明します。

（45から70までパーセント; 1,800 – 6,000 /μl）を好中球は、ヒトの循環内のすべての白血球の最大の人口を構成しているが、マウスでは、通常の条件下で、彼らは（10むしろ疎である – 15％、300から500 /μL ）。慢性炎症⁷の状態を示して着実に炎症時に時折癌における好中球数が増加します。好中球は多能骨髄系共通前駆体（CMP）CEから発生します骨髄中のLLS、骨髄芽球の段階を通過する分化プロセス（MB）を介して、前骨髄球（PM）、骨髄球（MC）、後骨髄球（MM）とバンド細胞^（BC）8。それらは循環⁸に放出される前に7日-成熟した、有糸分裂後の好中球は4のための骨髄内に残ることがあります。炎症状態の下で延長することができる12時間、 – 血液中の好中球の売上高は6の平均半減期は、通常、迅速です。非刺激好中球は、ホルボールエステルホルボール12にそれらを暴露することにより、抗腫瘍形成活性、ケモカインIL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5およびCXCL5 ^6,19または人工的にナイーブな好中球を露出することによって取得することができる機能を制限してきました-myristate 13-アセテート^{（PMA）6。}

一緒に好中球の数が少ないと血液の好中球の半減期が短い（〜3から5×10 ^5）ナイーブ6 1mlの血液から達成- 8週齢のマウス、それを作りましたin vitroでマウスの好中球を循環させる機能を探索することは困難。この困難を克服するために、他のソースが使用されています。例えば、好中球の多くは、（チオグリコレート培地またはザイモサンAの腹腔内注射後に、 例えば ）骨髄²⁰または無菌性炎症の誘導後腹膜から得ることができます。これは、腹腔から得られた好中球は、任意の抗腫瘍形成活性（未発表の観察）を及ぼさないことに留意すべきです。

Granot ら ^{6 20}れるよう、マウス4T1乳癌細胞株を用いて同所接種したBALB / cマウスは、腫瘍進行^6（ 図2A）で悪化好中球増加症を発症することが観察- 40万人の血液好中球は容易に1ミリリットルの血液から単離することができます3から4週間後、腫瘍接種。これらの好中球は、抗腫瘍活性を獲得し、それに応じてCOIされていますナイーブ好中球^6（ 図2B）と区別するために定義される腫瘍連行好中球（TEN）、。高密度の好中球（HDN、 図1（a））は非常に抗腫瘍形成であるが、癌との関連で発生した低密度の好中球（LDN、 図1B）は ²¹ではありません。また、腫瘍を有するマウスの骨髄および脾臓から高密度の好中球は、抗腫瘍活性（未発表データ）を有しています。これは、好中球の量が増加すると、腫瘍の進行に脾臓を徐々に拡大（脾腫）となることに留意すべきです。

これは、10にも自発的な（MMTV-PyMTおよびMMTV-Wnt1の乳腺腫瘍とのK-ras駆動肺腫瘍）の両方を含む癌の他のモデルで生成され、AT-3（MMTV-PyMT）とE0771の乳癌（注入されることに留意すべきです細胞、LLCルイス肺癌細胞およびB16-F10黒色腫細胞）。しかしながら、これらのTUMでの好中球動員の、程度3週間後に1ミリリットルの血液中の10×10 ⁶好中球-またはモデルが5に達し、4T1-接種されたマウスのよりもはるかに少ないです。