Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxovirus сопротивление (Mx) белки являются важной частью врожденной иммунной защиты против вирусных патогенов. Эти белки являются крупные динамин, как GTPases, индуцированные типа I и типа III интерфероны. Соответствующие гены Mx присутствуют почти во всех позвоночных, в одной или нескольких копий и их генные продукты ингибируют широкий спектр вирусов, включая Orthomyxoviridae (например., Вируса гриппа), Rhabdoviridae (например., Вируса везикулярного стоматита), буньявирусов (например. Ла вирус Кросс) и Retroviridae (например, вирус иммунодефицита человека-1) 1-4. Неясно, как эти белки признать такой широкий спектр вирусов, без всякой видимой поделился первичная последовательность мотивов в этих вирусов. Анализируя взаимодействие МХ белков с вирусной целей, потенциально с участием высшего порядка комплексы с другими факторами клеток хозяина, поможет понять молекулярные механизмы тшляпа развивались в гонке вооружений между вирусами и их хозяев.
Взаимодействие между млекопитающих белков Мх и вирусных целей была изучена наиболее широко для человека МхА. Человека MxA могут ингибировать репликацию многих вирусов, в том числе ортомиксовирусы гриппа А и вируса Thogoto. MxA связывает Thogoto вируса рибонуклеопротеидных комплексы (vRNPs), тем самым предотвращая их проникновение в ядро, что приводит к блоку инфекции 5. Это взаимодействие между МхА и Thogoto вирусных vRNPs было продемонстрировано совместное отстаивание и со-иммунопреципитации экспериментов 6-9. Как Mx белки препятствуют вирусов гриппа менее ясна. Одна из основных проблем является то, что это не просто продемонстрировать взаимодействие между белком Mx и гена гриппа продукта. Один доклад показал, взаимодействие человеческого МхА и белка НП в вирус гриппа А инфицированных клеток 10. Это взаимодействие может быть показано только путем совместного immunoprecipitation если клетки были обработаны сшивающего реагента дитиобис (сукцинимидилпропионат) до лизиса, предполагая, что взаимодействие является временным и / или слабым. Более поздние исследования показали, что дифференциальный Mx чувствительность различных штаммов гриппа А определяется по происхождению белка NP 11,12. В соответствии с этим, вирусы гриппа А, может частично уйти от Control MX путем мутации конкретных остатков в белке НП 13. Это говорит о том, что основной мишенью вирусов гриппа для принимающей Мх белок NP, скорее всего, NP собраны в vRNP комплексов. Тем не менее, ни один из этих более поздних исследованиях не было выявлено взаимодействия между гриппа НП или vRNPs и либо человека МхА или мыши MX1.
Недавно мы показали, впервые, взаимодействие между гриппом НП и MX1 белка мыши с оптимизированным протокол о сотрудничестве иммунопреципитации 14, который описан здесь подробно. В общем, со-Immunoprecipitation является одним из наиболее часто используемых биохимических методов, чтобы исследовать белок-белковых взаимодействий. Этот метод часто предпочтительнее, чем альтернативные методы, например дрожжи две гибридные, так как он позволяет исследовать белок-белковых взаимодействий в их естественной среде обитания. Со-иммунопреципитации можно проводить на эндогенно экспрессируемых белков, если антитела против белков, представляющих интерес доступны. Кроме того, белки интерес может быть выражен в клетке через трансфекции или инфекции, и аффинная метка может быть использована. В дополнение к вышеупомянутым преимуществам, описанным протоколом совместно иммунопреципитации позволяет детектировать слабые и / или переходных белковых взаимодействий. Основным компонентом в этом оптимизированного протокола является добавление N-этилмалеимида (NEM) в буфере для лизиса клеток. NEM представляет собой алкилирующий реагент, который реагирует с свободных тиоловых групп, таких как, присутствующего в цистеинов, при рН 6,5-7,5, с образованием стабильной тио-эфир(Фигура 1). При более высоких рН, NEM может также реагировать с аминогруппами или подвергаются гидролизу 15. NEM, как правило, используется, чтобы блокировать свободные тиольные группы, для того, чтобы предотвратить образование дисульфидной связью или ингибировать ферментативную активность. Например, NEM часто используется, чтобы блокировать desumoylating ферменты, которые цистеиновых протеаз. В описываемом протокола совместно иммунопреципитации, NEM был изначально включен в буфере для лизиса, потому что было сообщено, что SUMOylation белков гриппа может влиять на взаимодействие между вирусными белками 16. Неожиданно добавление NEM оказалась ключом к документу взаимодействие гриппа NP и мыши MX1 путем совместного иммунопреципитации. Непонятно, почему добавление NEM имеет решающее значение для выявления взаимодействия NP-MX1. Возможно взаимодействие слишком скоротечна и / или слабый. NEM может стабилизировать взаимодействие, например, путем сохранения специфической конформации MX1 и, вирусный белок или даже неизвестное третье компонента. Такое стабилизирующее действие NEM наблюдалось раньше, например, для взаимодействия рибонуклеотидредуктазы M1 и его ингибитора гемцитабина (F2dC) 17. MX1 и NP оба содержат несколько остатков цистеина, которые могут быть изменены NEM. Например, недавнее исследование Ренни и др. Продемонстрировали, что stalkless MxA-вариант содержит три растворителя подвергаются остатки цистеина, которые могут быть изменены иодацетамидом. Мутирует эти остатки серинов не влияет на ферментативную активность МхА, но предотвратить дисульфида-опосредованной агрегации 18. Поскольку эти цистеина сохраняется в классе MX1, это говорит о том, что аналогичные цистеина в классе MX1 могут быть изменены NEM и, таким образом повлиять на его конформации или растворимости. Кроме того, NEM также может влиять на активность ГТФ в MX1, что очень важно для борьбы с гриппом активности MX1, и тем самым стабилизировать взаимодействие между MX1 и NP. Тем не менее, прямое воздействие NEM на ГТФ ACTiVity MX1 и маловероятно, так как NEM также необходимо определить взаимодействие между гриппа НП и GTPase неактивные мутанты белка MX1 14. Очевидно, что необходимы дополнительные исследования, чтобы разгадать эффект NEM о взаимодействии NP-MX1.
Таким образом, описанные протокол о сотрудничестве иммунопреципитацию позволяет изучать взаимодействие между противовирусного белка MX1 и его вирусной цели, гриппа НП белка. Этот протокол также может быть использован для изучения других слабых или переходные взаимодействия, которые зависят от стабилизации конкретных конформации белков. Белок-белкового взаимодействия, что зависит от конкретных конформаций были описаны ранее, например, в кальций-связывающих белков, таких как кальмодулин 19. Наконец, полезно роль NEM также могут быть использованы в других способах, которые обнаруживают белок-белковых взаимодействий, такие как со-осаждения анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение взаимодействия между противовирусных белков и их вирусных целей очень важно, чтобы понять детали противовирусного механизма этих белков. Это может дать новые знания о том, вирусы и их хозяева совместно эволюционировали и быть основой для разработки новых противовирусных стр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана FWO Фландрии, проект ИОФ IOF10 / Startt / 027 и Гентский университет Специальный научно-исследовательский Грант BOF12 / ГОА / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
