Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Myxovirus Widerstand (Mx) Proteine ​​sind ein wichtiger Teil der angeborenen Immunabwehr gegen virale Pathogene. Diese Proteine ​​sind groß dynamin artigen GTPasen, die durch Typ I und Typ III Interferone induziert werden. Die entsprechenden Mx Gene in fast allen Wirbeltieren vorhanden sind in einer oder mehreren Kopien und deren Genprodukte hemmen ein breites Spektrum von Viren, einschließlich Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Virus), Rhabdoviridae (z. B. vesikuläres Stomatitis-Virus), Bunyaviridae (z. , La Crosse Virus) und Retroviridae (zB Human Immunodeficiency Virus-1) ^1-4. Es ist unklar, wie diese Proteine ​​erkennen, wie ein breites Spektrum von Viren, ohne ersichtlichen gemeinsamen primären Sequenzmotive in dieser Viren. Analyse der Interaktion von Mx-Proteine ​​mit den viralen Ziele, die möglicherweise mit höherer Ordnung Komplexe mit anderen Wirtszellfaktoren, wird dazu beitragen, die molekularen Mechanismen zu verstehen that in der Rüstungswettlauf zwischen Viren und ihren Wirten entwickelt.

Das Zusammenspiel von Säugetier Mx Proteine ​​und virale Ziele wurde sehr ausgiebig für den menschlichen M · A untersucht. Menschliche MxA können die Replikation vieler Viren, einschließlich der Orthomyxoviren Influenza A und Thogoto Virus zu hemmen. M · A bindet die Thogoto Virus Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs) und damit ihre Kern Eintrag, der in Block ⁵ der Infektion führt zu verhindern. Diese Wechselwirkung zwischen MxA und Thogoto Virus vRNPs wurde mit Co-Sedimentation und Co-Immunopräzipitation ^6-9 gezeigt. Wie Mx-Proteine ​​hemmen Influenza-A-Viren ist weniger klar. Ein Hauptproblem ist, dass es nicht einfach ist, eine Wechselwirkung zwischen einem Mx-Protein und einem Influenza-Genprodukt zu demonstrieren. Ein Bericht zeigte eine Interaktion zwischen Mensch M · A und der NP-Protein in Influenza A-Virus infizierten Zellen ^10. Diese Wechselwirkung kann nur durch Zusammen immunopr gezeigtecipitation wenn die Zellen mit dem Vernetzungsmittel Dithiobis (succinimidylpropionat) vor der Lyse behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung transiente und / oder schwach. Neuere Studien haben gezeigt, daß der Differenz Mx Empfindlichkeit verschiedener Influenza-A-Stämme wird durch die Entstehung des NP-Proteins ^11,12 bestimmt. Im Einklang mit dieser, können Influenza-A-Viren zum Teil aus Mx Kontrolle entziehen durch Mutation spezifische Reste in der NP-Protein ^13. Dies deutet darauf hin, dass das Hauptziel des Influenza-A-Viren, die für Wirts Mx das NP-Protein, in vRNP Komplexe wahrscheinlich NP montiert. Jedoch keines dieser neuere Studien zeigten eine Interaktion zwischen Influenza NP oder vRNPs und entweder menschlichen oder Maus MxA Mx1.

Kürzlich haben wir gezeigt, zum ersten Mal, eine Wechselwirkung zwischen dem Influenza NP und der Maus Mx1-Protein mit einer optimierten Zusammen Immunpräzipitationsprotokoll ^14, die hier im Detail beschrieben wird. Im allgemeinen co-immunoprecipitation ist einer der am häufigsten verwendeten biochemischen Ansätzen zur Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese Technik wird oft als Alternative Techniken, beispielsweise Hefe-Zwei-Hybrid bevorzugt, da sie es ermöglicht, Protein-Protein-Wechselwirkungen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Co-Immunfällung kann endogen exprimierten Proteine ​​durchgeführt werden, wenn Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse zur Verfügung. Alternativ können die Proteine ​​von Interesse in die Zelle durch Transfektion oder Infektion exprimiert werden, und ein Affinitäts-Tag verwendet werden. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen hat die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll ermöglicht die Detektion von schwachen und / oder transienten Protein-Interaktionen. Der Hauptbestandteil in dieser optimierten Protokolls ist die Zugabe von N-Ethylmaleimid (NEM) in der Zell-Lyse-Puffer. NEM ist ein Alkylierungsmittel, das mit freien Thiolgruppen wie gegenwärtig Cysteine ​​reagiert, bei einem pH von 6,5-7,5, um eine stabile Thio-Ester zu bilden(Abbildung 1). Bei höheren pH kann NEM auch mit Aminogruppen reagieren oder Hydrolyse ¹⁵ zu unterziehen. NEM wird typischerweise verwendet, um freie Thiolgruppen zu blockieren, um die Bildung einer Disulfidbindung zu verhindern oder zu hemmen, die enzymatische Aktivität. Zum Beispiel wird häufig verwendet, um NEM desumoylating Enzyme, die Cystein-Proteasen sind blockieren. In der beschriebenen Co-Immunpräzipitationsprotokoll wurde NEM anfänglich in dem Lysepuffer enthalten, da es war berichtet worden, dass die Sumoylierung von Influenzaproteine ​​können die Wechselwirkungen zwischen viralen Proteinen ¹⁶ beeinflussen. Unerwarteterweise ist der Zusatz von NEM erwiesen Taste, um die Wechselwirkung zwischen Influenza NP und Maus Mx1 durch Co-Immunpräzipitation dokumentiert sein. Es ist unklar, warum die Zugabe von NEM ist von entscheidender Bedeutung, um die NP-Mx1 Interaktion zu erkennen. Möglicherweise ist die Interaktion zu vorübergehenden und / oder schwach. NEM könnte die Interaktion, beispielsweise zu stabilisieren, unter Wahrung einer bestimmten Konformation Mx1, ein virales Protein oder sogar eine unbekannte dritte Komponente. Eine derartige stabilisierende Wirkung von NEM ist zuvor beobachtet worden, beispielsweise für das Zusammenwirken zwischen der Ribonukleotidreduktase M1 und sein Inhibitor Gemcitabin (F2dC) ^17. Mx1 und NP beide enthalten mehrere Cystein-Reste, die durch NEM modifiziert werden könnte. Zum Beispiel wird eine aktuelle Studie von Rennie et al., Dass ein stielfrei M · A-Variante enthält drei Lösungsmittel ausgesetzt Cysteinreste, die von Iodacetamid geändert werden können. Mutagenierten Reste Serine beeinflusste nicht die enzymatische Aktivität des MxA, aber verhindert disulfidvermittelte Aggregation ^18. Da diese Cysteine ​​in Mx1 erhalten, bedeutet dies, dass die analogen Cysteine ​​in Mx1 durch NEM und als solche beeinflussen dessen Konformation oder Löslichkeit modifiziert werden. Außerdem könnte NEM beeinflussen auch die GTPase-Aktivität von Mx1, die für die Anti-Influenza-Aktivität Mx1 ist, und dadurch die Wechselwirkung zwischen Mx1 und NP stabilisieren. Allerdings ist eine direkte Wirkung von NEM auf der GTPase activität der Mx1 ist unwahrscheinlich, da NEM ist auch erforderlich, um die Interaktion zwischen Influenza NP und GTPase inaktive Mutanten des Mx1 Protein ¹⁴ zu erkennen. Es ist klar, ist mehr Forschung notwendig, um die Wirkung von NEM auf der NP-Mx1 Interaktion zu entwirren.

Zusammenfassend ermöglicht die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll, um die Wechselwirkung zwischen der antiviralen Mx1-Protein und seine virales Ziel, das Influenza-NP-Protein zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um andere schwache bzw. transiente Interaktionen, die auf die Stabilisierung der spezifischen Proteinzustände hängen untersuchen. Protein-Protein-Wechselwirkung, die auf spezifische Konformationen abhängig sind zuvor beschrieben worden, beispielsweise Calcium-bindende Proteine ​​wie Calmodulin ^19. Schließlich könnte die vorteilhafte Rolle der NEM auch andere Methoden, die Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Ko-Sedimentation Assays verwendet werden.