Isolement de leucocytes des tissus murins à l'interface materno-foetale

La tolérance immunitaire à la grossesse est une période pendant laquelle se produisent les changements distincts dans le système immunitaire de la mère. Ces changements permettent à la mère de tolérer le fœtus, une greffe allogénique ^semi-1. Le fœtus exprime paternelle complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) ^2, et les cellules foetales ont été trouvés dans la circulation maternelle ^3; Cependant, le fœtus ne soit pas rejeté ^4,5. Cette énigme est pas entièrement comprise.

L'hypothèse la plus récente indique que la tolérance materno-fœtale est créé pendant le coït et la fécondation ^6,7 et maintenu pour soutenir une grossesse à terme ^8-10. Une ventilation de cette tolérance foeto-maternelle est considéré comme un mécanisme de la maladie au cours des premiers et derniers stades de la grossesse ^10-16. La tolérance foeto-maternelle implique la participation de diverses sous-populations de leucocytes, y compris les cellules T (cellules T régulatrices, les cellules Th1, Th2, et les cellules Th17), Macrophages, les neutrophiles, les mastocytes, les cellules NK et les cellules NKT, les cellules dendritiques et les cellules B, que le changement de la densité et de la localisation pendant la grossesse ^15,17-19. La tolérance materno-fœtale est enrichi à l'interface materno-fœtale ²⁰ – le site anatomique où le système immunitaire de la mère interagit avec les antigènes foetaux ^20,21.

L'interface materno-fœtale est créé lors de la placentation lorsque les cellules du trophoblaste extravilleux fœtales envahissent la muqueuse utérine ^22-24. Sur le côté fœtal de cette interface, les membranes entourant le fœtus créer une surface épithéliale spécialisé du placenta, et les cellules syncytiotrophoblaste contrôler l'échange des nutriments par leur contact direct avec le sang maternel ^22. Du côté de la mère de l'interface, la caduque recrute une piscine hétérogène de leucocytes chez les souris qui représentent 30% à 50% de toutes les cellules déciduales. En plus de leur participation à Materntolérance immunitaire al, ces cellules sont les principaux contributeurs à différents processus pendant la grossesse, par exemple., la protection de l'appareil reproducteur des infections, la fécondation, l'implantation d'embryons ^7,25, l'angiogenèse décidual ^26, le remodelage vasculaire ^24,27, l'invasion du trophoblaste ^28, placentaire ^24,25 développement, et, finalement, le travail et la livraison ^15,17. Par conséquent, l'étude des leucocytes impliqués dans la tolérance foeto-maternelle est essentielle pour élucider la pathogenèse des complications liées à la grossesse.

Bien que l'utilisation de l'immunohistochimie et l'immunofluorescence a généré des données pour la visualisation directe et la localisation de l'utérus, déciduale, ou leucocytes ^29,30 placentaires, l'analyse par cytométrie en flux a révélé en outre des sous-ensembles spécifiques de leucocytes dans chacun de ces tissus ^31,32. En outre, la cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer la densité et la proportion de materInterface nal-fœtale leucocytes ³³ et d'expression des niveaux de protéines extracellulaires et intracellulaires ^8-10,34. Analyse des flux cytométrique des leucocytes à l'interface materno-fœtale nécessite une suspension à cellule unique. Afin d'isoler les leucocytes infiltrants du déciduale, de l'utérus et les tissus placentaires, deux méthodes de dissociation de tissus ont été utilisées: mécanique et enzymatique. Les deux procédés permettent la séparation des leucocytes infiltrés de la matrice extracellulaire (ECM) de ces tissus. Dissociation enzymatique du tissu est supérieure à la dissociation mécanique de tissu, car elle permet un rendement plus élevé de leucocytes avec des dommages moins cisaillement de force associé ^35. Par conséquent, la dissociation de tissu mécanique nécessite la mise en commun des tissus ^36, ce qui peut augmenter la variabilité et l'hétérogénéité des échantillons. Cependant, la dissociation mécanique peut être le choix lorsque l'antigène d'intérêt peut être modifiée par dissociation enzymatique ou lorsque la fonctionnalité de la cellules d'intérêt doivent être préservées (par ex., la cytotoxicité des cellules NK) ^35.

L'utilisation de la protéolyse avec des enzymes spécifiques à dégrader l'ECM élimine les faibles rendements observés avec dissociation mécanique. Plusieurs études ont rapporté l'utilisation de la trypsine ^{32, 37} collagénase, DNase ^31, Dispase ^38, et des cocktails commerciales de divers enzymes ^32,39. Cependant, la nature et la concentration des différentes enzymes et la durée de digestion doivent être soigneusement définies et validées en vue d'assurer le maintien de l'intégrité des epitopes antigéniques de la surface des cellules requises pour l'immunophénotypage. Les différentes structures de surface sont différentiellement sensibles à la destruction par différentes enzymes, avec des enzymes telles que la trypsine, qui est connu pour le décapage des épitopes de surface des leucocytes reconnus par de nombreux anticorps monoclonaux.

Introduit le présent mémoire est un procédé utilisant un proteolytic et cocktail enzymatique collagénolytique, appelé Accutase. Cette solution enzymatique est assez doux tout en performant à dissocier tissus murins à l'interface materno-fœtale, et ne nécessite pas l'ajout d'autres réactifs ou du sérum de dissociation de mettre fin à la réaction de dissociation. En outre, il est prêt à être utilisé tel que fourni et, bien que le temps de dissociation doit être validé, il est plus robuste que les enzymes mentionnées ci-dessus ^40,41.

L'utilisation d'une combinaison des deux types de désagrégation du tissu améliore la qualité et la quantité de cellules obtenues; Ainsi, plusieurs études ont mis en œuvre l'utilisation combinée de dissociation mécanique et enzymatique avec des résultats satisfaisants ^31,32,37. Le protocole décrit ici a été établie et validée dans notre laboratoire; il utilise une combinaison d'une dissociation mécanique douce suivie d'une décomposition enzymatique solide. Ce protocole permet l'étude d'isolement et continue desles leucocytes infiltrants dans les tissus murins à l'interface materno-fœtale (utérus, caduque, et le placenta). Le protocole suivant maintient également l'intégrité des marqueurs de surface cellulaire et des rendements de cellules viables suffisant pour les applications en aval tel que démontré par une analyse par cytométrie de flux. Enfin, ce protocole maintient la cohérence de préparation de cellules pour l'analyse et la comparaison des différents tissus murins composant l'interface materno-fœtale.