Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico ^semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de ^2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna ^3; sin embargo, el feto no se rechaza ^4,5. Este enigma no se entiende completamente.

La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación ^6,7 y mantenido para sostener un embarazo a término ^8-10. El desglose de esta tolerancia materno-fetal se considera un mecanismo de la enfermedad durante las primeras y últimas etapas del embarazo ^10-16. La tolerancia materno-fetal consiste en la participación de los diversos sub-poblaciones de leucocitos, incluyendo las células T (células T reguladoras, las células Th1, células Th2 y células Th17), macrophages, neutrófilos, mastocitos, células NK, y células NKT, células dendríticas y células B, que el cambio en la densidad y localización durante todo el embarazo ^15,17-19. Tolerancia materno-fetal se enriquece en la interfase materno-fetal ²⁰ – el sitio anatómico donde el sistema inmune de la madre interactúa con los antígenos fetales ^20,21.

Se crea la interfaz materno-fetal durante la placentación cuando las células trofoblásticas extravillous fetales invaden la mucosa uterina ^22-24. En el lado fetal de esta interfaz, las membranas que rodean al feto crean una superficie epitelial especializada dentro de la placenta, y las células sincitiotrofoblasto controlan el intercambio de nutrientes a través de su contacto directo con la sangre materna ^22. En el lado materno de la interfaz, el decidua recluta una piscina heterogéneo de leucocitos en ratones que representan el 30% a 50% de todas las células deciduales. Además de su participación en maternAl tolerancia inmune, estas células son los principales contribuyentes a los distintos procesos durante el embarazo, por ejemplo., la protección del tracto reproductivo de las infecciones, la fecundación, la implantación del embrión ^7,25, la angiogénesis decidual ^26, remodelado vascular ^24,27, la invasión del trofoblasto ^28, de la placenta desarrollo ^24,25, y, en última instancia, el trabajo y la entrega ^15,17. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos implicados en la tolerancia materno-fetal es esencial para dilucidar la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo.

Aunque el uso de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ha generado datos para la visualización directa y localización de uterina, decidual, o leucocitos placentarios ^29,30, citometría de flujo análisis ha revelado también subconjuntos específicos de leucocitos en cada uno de estos tejidos ^31,32. Además, la citometría de flujo se ha utilizado para determinar la densidad y la proporción de maternal-fetal interfaz de leucocitos ³³ y de expresión los niveles de proteínas extracelulares e intracelulares ^8-10,34. Análisis de citometría de flujo de leucocitos en la interfase materno-fetal requiere una suspensión de una sola célula. Con el fin de aislar los leucocitos infiltrantes de la decidual, uterino, y tejidos de la placenta, se han utilizado dos métodos de disociación de tejidos: mecánica y enzimática. Ambos métodos permiten la separación de los leucocitos infiltrados de la matriz extracelular (ECM) de estos tejidos. Disociación enzimática de tejido es superior a la disociación de tejido mecánica, ya que permite un mayor rendimiento de los leucocitos con daño asociado a la fuerza de cizallamiento menos ^35. En consecuencia, la disociación de tejido mecánico requiere la agrupación de tejidos ^36, que pueden aumentar la variabilidad y la heterogeneidad de las muestras. Sin embargo, la disociación mecánica puede ser la opción cuando el antígeno de interés puede ser alterada por disociación enzimática o cuando la funcionalidad de la células de las necesidades de interés que se conserva (por ejemplo., la citotoxicidad de las células NK) ^35.

El uso de la proteolisis con enzimas específicas para degradar la ECM elimina los bajos rendimientos observados con disociación mecánica. Varios estudios han reportado el uso de tripsina ^32, colagenasa ^37, DNasa ^31, Dispasa ³⁸ y cócteles comerciales de diversas enzimas ^32,39. Sin embargo, la naturaleza y concentración de diferentes enzimas y la duración de la digestión deben ser meticulosamente definidos y validados con el fin de asegurar el mantenimiento de la integridad de los epítopos antigénicos de la superficie celular necesarias para inmunofenotipo. Las diversas estructuras de la superficie son diferencialmente susceptibles a la destrucción por diferentes enzimas, con algunas enzimas, tales como tripsina, siendo notorio para pelar epítopos de superficie de leucocitos reconocidos por muchos anticuerpos monoclonales.

Introducido en el presente documento es un método que utiliza un proteolytic y cóctel enzimático colagenolítica, llamado Accutase. Esta solución enzimática es lo suficientemente suave mientras que todavía eficiente en disociar tejidos murinos en la interfase materno-fetal, y no requiere la adición de otros reactivos o suero de disociación para terminar la reacción de disociación. Por otra parte, está listo para usar tal como se suministra y, aunque el tiempo de disociación debe ser validado, es más robusto que las enzimas mencionadas anteriormente ^40,41.

La utilización de una combinación de ambos tipos de desagregación del tejido mejora la calidad y la cantidad de células obtenidas; Por lo tanto, varios estudios han implementado el uso combinado de disociación mecánica y enzimática con resultados satisfactorios ^31,32,37. El protocolo descrito en este documento se estableció y validó en nuestro laboratorio; que utiliza una combinación de una disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto. Este protocolo permite el estudio y el aislamiento adicional delos leucocitos infiltran en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (útero, decidua y placenta). El siguiente protocolo también mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y los rendimientos de células viables suficiente para aplicaciones posteriores como se demuestra por análisis de citometría de flujo. Finalmente, este protocolo mantiene la consistencia de la preparación de células para el análisis y la comparación de diferentes tejidos murinos que componen la interfaz materno-fetal.