Summary

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

Published: October 05, 2015
doi:

Summary

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Abstract

نقل بالتبني من الخلايا T الممرض محددة يمكن استخدامها لمنع وعلاج الأمراض الانتهازية مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى التي تحدث بعد خيفي المكونة للدم زرع الخلايا الجذعية. خلايا T الفيروسية محددة من الجهات المانحة خيفي، بما في ذلك الجهات المانحة طرف ثالث، يمكن نشر السابقين الجسم الحي في الامتثال مع الممارسة الحالية التصنيع الجيدة (المركب)، وتوظيف الجولات المتكررة من التحفيز يحركها مستضد لنشر انتقائي خلايا T المطلوب. ويمكن أيضا أن تضطلع تحديد وعزل الخلايا T مستضد معين بناء على نظام التقاط خلوى الخلايا T التي تم تفعيلها لإفراز الإنترفيرون جاما (IFN-γ). ومع ذلك، التطبيق البشري على نطاق واسع للنظام التقاط خلوى (CCS) للمساعدة في استعادة الحصانة كانت محدودة لأن عملية إنتاج تستغرق وقتا طويلا وتتطلب مشغل المهرة. تطوير جهاز لتخصيب الخلية الجيل الثاني مثل CliniMACS معجزة الآنتمكن المحققون على توليد خلايا T الفيروسية محددة باستخدام، أقل النظام كثيفة العمالة الآلي. هذا الجهاز يفصل صفت مغناطيسيا الخلايا من الخلايا غير المسماة باستخدام المغناطيسية تنشيط الخلايا التكنولوجيا الفرز لتوليد المنتجات السريرية الصف، كما تم تصميم نظام مغلق ويمكن الوصول إليها وتعمل على الفوق. ونحن لشرح تشغيل هذا الجهاز الجديد لتخصيب الخلية الآلي لتصنيع خلايا T pp65 محددة CMV تم الحصول عليها من المنتج فصادة الحالة المستقرة التي تم الحصول عليها من متبرع مصاب بالفيروس المضخم للخلايا. ويمكن بعد ذلك هذه الخلايا T معزولة أن غرست مباشرة إلى المريض تحت الإشراف التنظيمي المؤسسي والاتحادي. كل الخطوات لمعالجة الحيوية بما في ذلك إزالة خلايا الدم الحمراء، ومؤتمتة بالكامل تحفيز خلايا T، وفصل الخلايا مستضد معين T، وتنقية، والغسيل. الأجهزة مثل هذه تثير احتمال أن خلايا T للتطبيق البشري يمكن تصنيعها خارج مخصصة الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) أن تنتج المرافق وبدلا من ذلك في التسهيلات المصرفية الدم حيث يمكن للموظفين الإشراف بروتوكولات الآلي لإنتاج منتجات متعددة.

Introduction

للدم زرع الخلايا الجذعية (HSCT) 1 يمكن الجمع بين العلاج T-خلية بالتبني لتحسين الطعم ضد الورم تأثير وتوفير الحصانة للعدوى الانتهازية 2. جيل من الخلايا T-المستمدة المانحة مستضد معين للتسريب قد تطلبت من الناحية التاريخية الموظفين المهرة واستخدام المرافق المتخصصة التي GMP المتوافقة. وقد نتج عن تسليم مثل هذه الخلايا T في القرار من العدوى الانتهازية 3 وكذلك علاج الورم الخبيث الكامن 4. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت المحققين أن نقل بالتبني من بضعة آلاف فقط خلايا T الفيروس محددة (~ 1 × 10 4-2،5 × 10 5 خلايا / كغم من وزن الجسم المتلقي) يمكن علاج الالتهابات الانتهازية CMV بعد خيفي HSCT 5-9 بنجاح. وهناك عدد محدود من مرافق GMP بما يرتبط بها من متطلبات التصنيع الماهرة والتكلفة العالية المرتبطة بإنتاج الخلايا ومع ذلك، فقد restricted وصول المريض إلى اعدا العلاجات T-10 خلية. ويستند نهج واحد لعزل خلايا T مستضد معين على CCS باستخدام كاشف ثنائية محددة للاعتراف CD45 وIFN-γ. كما هو مبين، هذه المنهجية يمكن استخدامها لتوليد السريرية الصف CMV محددة خلايا T توظيف مؤتمت الجهاز CCS تخصيب الخلية (الشكل 1B).

يتم إنشاء خلايا T CMV الخاصة التي يحتضنها الببتيدات متداخلة من CMV pp65 المستضد مع مجموع الخلايا فصادة الكريات البيض النووية (TNC) من المانحين CMV-مصليا. هذه الببتيدات، المعروضة في سياق الكريات البيض مستضد البشرية (HLA)، وتفعيل خلايا T CMV pp65 محددة داخل المجلس الوطني الانتقالي لإفراز الإنترفيرون γ. هذه الخلايا T ويمكن بعد ذلك أن "القبض" وفصل مغناطيسيا. تشغيل الجهاز من الجيل الأول لتخصيب الخلية (الشكل 1A) المطلوبة الموظفين المهرة في زراعة الخلايا في ظل ظروف GMP، والتنسيق من الموظفين للقيام ليالي متعددةteps اللازمة لتوليد منتج "القبض".

الإجراء المطلوب عادة 10-12 ساعة من العمل المتواصل، وبالتالي من المرجح الموظفين بحاجة إلى العمل على فترتين في منشأة GMP. ويتجنب هذه القيود الآن من تنفيذ جهاز الجيل الثاني (هو مبين في الشكل 1B). يتعهد هذا الجهاز تخصيب المغناطيسي، مماثل لجهاز الجيل الأول، ولكن بأتمتة جوانب أخرى من قانون الأحوال المدنية في نهج unbreached. هذا يخفف كثيرا من عبء على الفريق GMP لأن معظم الخطوات التي يمكن أن يتحقق دون مراقبة من قبل الموظفين. وعلاوة على ذلك، لأن الجهاز يعمل كنظام مغلق، وخلايا T مستضد معين يمكن الحصول عليها ومعالجتها على الفوق باستثناء الخطوات المتبعة في عزلة فصادة الكريات البيض وإعداد المواد قبل البدء في الصك. وقد حانة تفاصيل الأجهزة كاملة وظيفة هذا الجهاز تخصيب الخلية الجيل الثانيأسسنا 11.

هنا، نحن تصف الخطوات لإثراء CMV خلايا T pp65 محددة من منتج فصادة الحالة المستقرة باستخدام نظام CCS تخصيب الخلية الآلي. معزولة مرة واحدة، وهذه الخلايا T-CMV محدد قد غرست مباشرة إلى المريض.

Protocol

1. إعداد المواد تحت العقيمة شروط (انظر المواد والمعدات الجدول) إعداد 3 L من PBS / EDTA العازلة تستكمل مع ألبومين المصل البشري (HSA) إلى تركيز النهائي من 0.5٪ (ث / ت). إعداد 1 L كيس من السريري الصف 0.9٪ كلوري?…

Representative Results

في هذه الدراسة، تم استخدام خلية الآلي التخصيب نظام CCS لإنتاج الآلي من CMV خلايا T pp65 محددة. تم تخصيب خلايا T CMV محددة من ثلاثة منتجات خلية فصل مكونات الدم. كان حصادها المنتج فصادة الحالة المستقرة أكثر من 2 ساعة من المانحين CMV مصليا ولدت 10 10 مجموع الخلايا النووية (TNC). 10 …

Discussion

وقد برز العلاج T-خلية بالتبني كخيار قابل للتطبيق لعلاج الأورام الخبيثة B-الخلية 4. إمكانات علاجية تعتمد على غرس العدد المطلوب من الخلايا T محددة المستضد الهدف التي تفتقر تنسخي الشيخوخة 2. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الفصل بين السكان نقية من خلايا T معينة مستضد من…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.

Materials

CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 mL Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

References

  1. Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
  2. Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
  3. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  4. Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
  5. Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
  6. Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
  7. Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
  8. Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
  9. Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
  10. Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
  11. Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
  12. Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  13. Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
  14. Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
  15. Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
  16. Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
  17. Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

View Video