We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
荧光介导的断层摄影(FMT)使纵向和定量测定体内的荧光分布的,并且可以用来评估的新颖的探针的生物分布和使用已建立的分子探针或报道基因,以评估疾病进展。用解剖形态, 例如所述的组合,微计算机断层扫描(μCT),有利于图像分析和荧光重建。我们描述了一个协议,用于多μCT-FMT成像,包括必要的提取定量测量的图像处理步骤。制备小鼠和执行成像后,多峰数据集被注册。随后,改进荧光重建被执行时,它考虑到鼠标的形状。对于定量分析,器官分割是基于使用我们的交互式分割工具的解剖数据生成。最后,将生物分布立方米使用间歇处理特征生成rves。我们表明了该方法的适用性通过评估一个众所周知的探针结合于骨和关节的生物分布。
荧光介导的断层扫描,也称为荧光分子断层摄影术(FMT),是一种有前途的技术,以定量评估弥漫组织,如麻醉小鼠甚至人体组织, 例如 ,乳房或指关节的荧光分布。与此相反,以非侵入性的显微技术,其允许浅表目标成像在亚细胞分辨率1,格式化允许荧光光源在深度几厘米,尽管三维重建在较低的分辨率2。许多靶向荧光探针可用来图像的血管生成,细胞凋亡,炎症,和其他2 – 5。有些探头激活, 例如通过特定酶切割导致荧光的unquenching。此外,表达荧光蛋白的报告基因可以被成像, 例如 ,以跟踪肿瘤细胞迁移6。
FMT强烈受益于结合解剖形态, 例如 ,μCT2,7或MRI 8。而独立的FMT装置是市售装置9中,荧光图像是困难而不解剖参考的信息以解译。最近,我们能够显示,该熔融解剖图像数据能够更可靠的分析10。解剖数据还可以用于提供先验知识,例如鼠标,这对精确的光学建模和荧光重建11重要的外部形状。此外,光散射和吸收的地图可使用组织类型的分割来估计并通过分配类特定系数12,13。对于近红外光,血红蛋白的主要吸收在小鼠中,除了黑色素和毛皮14。由于相对血容量数量级区域而变化,一个吸收图是用于全特别重要titative荧光重建13。
使用非侵入性的成像装置的一个优点是,可使小鼠纵向进行成像, 即,在多个时间点。这是重要的,以评估探针的动态特性, 即,它们的目标积累,生物分布和排泄10,15,或评估疾病进展16。当在多个时间点成像几个小鼠中,大量的图像数据集产生。启用可比性,这些应以系统的方式, 即获得,具有良好定义和记录协议。大量扫描构成图像分析,这是需要提取的图象数据的定量测量是一个挑战。
我们研究的目的是要提供使用了的和优化的μCT-FMT成像协议的详细描述,在整个几个研究10,13,15,17,18。我们描述如何生成数据集,处理,可视化,并进行分析。此使用证明已建立的分子探针,OsteoSense,结合羟基磷灰石19,并可以用于图像骨骼疾病和重塑2。所有涉及动物的程序批准了关于动物保护的政府审查委员会。
我们描述和应用协议多式联运μCT-FMT成像。我们用市售的和广泛使用的裂变材料条约和μCT设备3,11,15 – 17,21。而该协议需要特定的格式化,所述μCT可以被另一个μCT具有类似功能和可比扫描参数,例如被取代,视场应足够大,以覆盖鼠标床包括标记。
该FMT是用于生物分布分析,而没有用μCT或MRI 21结合,但是,所述解剖数据是有益的,以增加可重复性,因为该分割可以基于器官边界;这些都是μCT数据10可见。而集成的μCT-FMT设备已经开发2,7,这些都不是市售呢。此外,使用两个单独的设备允许管道, 即 ,下一个鼠标钙N为成像在μCT而第一鼠标仍然在格式化,以增加吞吐量。
为了减少人工工作量,我们执行自动标记检测和融合。此外,鼠标的形状被自动分段并且此信息显著改善了荧光重建11,13,22。用于定量荧光的重建,需要吸收和散射映射13,23。我们推导散射地图由μCT数据的自动分段和分配几个组织类型的已知散射系数(肺,骨,皮肤,脂肪,和剩余的软组织)24。随后,我们重构吸收图从光的原始数据是用于良好灌注器官,如心脏和肝脏13,20尤为重要。
在多个时间点在扫描几个小鼠很快导致大量的数据集进行分析。对于biodistribution研究,几种器官需要被分割为每个μCT-FMT扫描。不幸的是,分割不能重复使用,因为鼠标新反复定位到小鼠床。我们使用交互式分割工具,在我们研究所开发的,然而,其它的工具也可能是适当的25。我们生成素明智的分割,因为这些搭配好复杂的器官不是简单的形状,如椭圆和立方体26。自动全动物分割将是有用的,以进一步减少手工工作量27,但是交互式分割工具仍需要以校正分割误差。此外,自动分割工具很难预料的特殊情况下,如病理正确。由于我们使用本地μCT扫描,一些器官如脾脏是非常困难的,甚至细分手动。造影剂会有所帮助,但有问题的耐受性,这是难以maintai纵贯全境成像呐稳定造影剂分布。
我们的幻像的研究表明,该信号定位是使用形状信息为荧光重建时改善。 在体内 ,有类似的改进是显而易见的早期时间点(注射后15分钟),当大量的探针在已经是膀胱。羟基磷灰石结合探头积聚在骨骼和关节。值得注意的是如何快速发生这种情况, 即 ,该信号已经在注射后脊柱15分钟清晰可见。这大概是由探头,它可以快速外渗并扩散到目标区域的低分子量导致的。该探针结合共价与其靶羟基磷灰石和未结合的探针被排出体外。对于稍后的时间点,6小时和注射后24小时之间,在脊柱的信号强度保持相对稳定,很可能是因为几乎没有任何重光酸痛深入到鼠标漂白的荧光。对于我们的研究中,我们使用的750纳米通道,这导致在低背景荧光的明显对于注射前获得的扫描。在较低的波长,更多的背景信号可以预期28。
总之,我们描述了用于市售FMT和μCT装置多模式成像协议。我们表明,该组合提供了荧光重建的好处。我们说明如何的生物分布曲线是从大量的图像数据的由交互式器官分割和批量处理装置提取。我们认为,这一标准化工作流可以是用于药物开发和使用荧光标记的探针等影像学很有帮助。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢马雷克韦勒进行幻像实验。这项工作是由欧洲研究委员会(ERC启动格兰特309495:NeoNaNo)的支持下,北莱茵 – 威斯特法伦州的德国联邦州(NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2 PROGRAMM(EFRE); ForSaTum),德国教育部和研究部(BMBF)(资助方案虚拟肝(0315743),LungSys(0315415C),LungSys2(0316042F),Photonik Forschung德国(13N13355)),亚琛工业大学(我TM 3种子基金),以及飞利浦研究(亚琛,德国)。
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |