Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
Retina pigment epitel (RPE) hücreler, fotoreseptör dış segmentleri (POS) harcanan yaşlı uzak parçalarının fagositoz hayati fonksiyonlarından biri Analizi in vitro yapılabilir. Fototransdüksiyon makineleri içeren membranöz diskler yığınları ile fotoreseptör dış segmentleri sürekli retinada yenilenmektedir. Harcanan POS RPE hücreleri tarafından günlük olarak elimine edilir. Kemirgen, domuz / sığır ve insan RPE hücreleri, benzer bir şekilde, çeşitli türlerden POS tanır. Küçük değişkenlik deneylerin büyük bir dizi performans sağlamak için, POS büyük bir stok domuz gözlerinin izole edilir ve eşit miktarlarda dondurulmuş olarak saklanır. Bu protokol, karanlıkta muhafaza edildiğinde, turuncu bir renk gösterir photopigments özelliklerini yararlanır. Loş kırmızı ışık altında, yarım kesilmiş açılan eyecups bir tampon içinde retinae toplanır. retinal hücre süspansiyonu, homojen bir devamlı sükroz gradyanı üzerinde süzüldü ve sütuna yüklenir. Cen sonratrifugation POS karakteristik turuncu bir renge sahiptir gradyanının üst kısmında ayrı bir bant bulunur. POS daha sonra toplandı, bükülmüş, yıkama tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, sırasıyla, sayılır ve bölünür. Bu şekilde elde edilen POS fagositoz tahlilleri ve POS uygulamasından sonra, çeşitli zamanlarda protein aktivasyonu, lokalizasyonu veya etkileşim analizi için kullanılabilir. Alternatif olarak, POS ör. Florofor ile etiketlenebilir örn., FITC, daha sonra floresan bağlayıcı POS miktarının veya yutulma için aliquoting önce. Diğer olası uygulamalar oksidatif stres ya da RPE hücrelerinin yaşlanma etkilerini incelemek için stres koşulları ile birlikte modifiye POS veya POS meydan kullanımını içerir.
Introduction
Retinasında, görme beyinde görsel alana kadar nöronlar arasındaki iletilebilir bir sinyal haline dönüştürülmeden önce, opsins adı ışığa moleküllerin izomerizasyonu ile tetiklenir. Bu moleküller, fotoreseptör hücrelerinin dış segment bölümlerini (PR) oluşturan krep benzeyen membranöz disklerin yığınlarının içinde gömülü. Işık ve oksidatif stres dolayısıyla önemli seviyelere sürekli maruz tabi olmak, PR sürekli potansiyel oksidatif hasarı sınırlamak için dış segmentleri yenilemek. Fotoreseptör dış segmentleri komşu retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin apikal mikrovilluslu yakın temas halindeyiz. RPE hücreleri, kan-retina bariyerinin dış kısmını oluşturan ve melanin pigmentleri, fotoreaktif opsin bileşeni Retinal'in yeniden izomerizasyonuna sağlayan besin ve g yoluyla ışık ışınları söndürme gibi fotoreseptör sağlık ve fonksiyonu 1 için çok önemli olan çok sayıda görev, sağlamakPR metaboliti bertaraf katılan faktörler rowth.
Buna ek olarak, RPE hücreleri POS geçirdi ve onların bileşenleri, memeli retina 2,3 sirkadiyen ritim tarafından düzenlenen bir günlük işgal geri dönüşüm ortadan kaldırmak. sundurma POS boşluk PR hayatta kalmak için kesinlikle gereklidir. Tamamen kaldırılmıştır zaman, POS enkaz birikir ve PRs hızlı görme kaybı 4,5 neden dejenere. Ritmik profil kaybetti ve sabit aktivitesi ile değiştirilirse, PR ve RPE kusurlar yaş 6 birikir. Bu nedenle, bu da fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı fenotipler anlaşılması için in vitro RPE fagositoz moleküler düzenleme karakterize etmek için çok önemlidir. İlginçtir, RPE hücrelerinde moleküler makineleri apoptotik hücreleri temizlemek için makrofajlar tarafından kullanılan bir çok benzer ve her ikisi de fagositik enkaz 7-9 maruz fosfatidilserin tanınması bağlıdır. Yine, RPE hücreleri ve makrofajlar ph düzenleyenmakrofajlar karşılaşma anda apoptotik hücrelerin hemen ortadan kaldırılması için tercih olarak agocytosis farklı, RPE hücreleri ritmik dış kesimleri ile sürekli temas rağmen bir günde sadece bir kez POS yutmak ise. Bu henüz tam olarak anlaşılmış değildir özgü düzenleme mekanizmalarını önerir.
RPE fagositik makine implike moleküllerin bir çoğu bu tanımlanmış ya da izole edilmiş bir POS ve hücre kültürü fagositoz tahlillerin kullanımı sayesinde doğrulanmıştır. onun ligandı MFG-E8 ile koordineli olarak RPE apikal hücre yüzeyinde bulunan alfa beta5'in integrin reseptörü, ardından MerTK tirozin kinaz reseptörü 13-15 yoluyla içselleştirilmiş olan POS 10-12, özellikle bağlanır. CD36 çöpçü reseptör POS alımı katılmak ve hızını 16,17 etkilemek için gösterilmiştir, ve POS yüzeyi 18 oksitlenmiş fosfolipidlerin bir sensör olarak kullanılabilir. Içselleştirilmesi F-aktin hücre iskeleti-eşek işe ihtiyacıBöyle anneksin 2 19, miyozin II 20 ve miyozin VIIA 21,22 olarak ociated proteinler. In vitro olarak doğal ya da oksitlenmiş POS da az sindirilmiş oksitlenmiş POS 23-28 birikimine bağlı, in vivo olarak, RPE hücreleri yaşlanma fenotipleri anlamak için kullanılmaktadır. akış önleme hücrelerinden hasıl RPE hücrelerinin üretimi, hayvanların ya da hasta 29,30,27 nakledilen önce hücrelerin özelliğe kanıtlamak için kullanılan izole edilmiş bir POS için yeni bir uygulama başlatmıştır.
İlk 1987 yılında 31 Molday ve arkadaşları tarafından tarif, sığır POS izolasyonu için protokol (11- sis retina taşıyan) ağartılmamış retina photopigment karakteristik portakal görünümü gözlem sürekli sakaroz Yokuşta retina homojenatlarının bir Ultrasantrifügasyon adımını birleştirir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, deli dana hastalığı riskini en aza indirmek amacıyla alınan önlemler nedeniyle, domuz gözlerin kullanımı increasi haline gelmiştirngly belirgin. Burada açıklanan protokol domuz veya numune alınır ve uzun bir süre boyunca saklanabilir sığır gözlerden POS büyük miktarlarda elde etmek için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu POS hazırlanması ve analiz 32,33,21,22 başına hayvan çok sayıda kullanımını gerektiren, kemirgen gözlerden POS hazırlanması ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak, floresan molekülleri kullanarak depolama önce POS etiketleme ile ilgili ayrıntılar ölçmek ve fagositoz tahlil 32,10 sonra etiketleme POS göre bazı uygulamalar için basitleştirilmiş ve karşılaştırılabilir bir şekilde POS görselleştirmek için, verilir. Bu nedenle, bu büyük stoklar deneyler birçok farklı tipte yeniden üretilebilirlik ve kullanım kolaylığı için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Üç adım veya durumlar optimize saflaştırma için önemlidir: dereceli döküm ve hassas gradyan borular manipülasyon kalitesi, soğutulmuş ve toplama aşamasında kadar karanlıkta dokuları tutarak, retina homojenatlarının çalkalama gücü PR geri kalanından uygun POS izolasyon elde etmek için hücresidir. Bazı sorunlar düzgün turuncu bant görmeye ortaya çıkarsa, bunlar dolayı yukarıdaki üç nedenden biri (aynı zamanda Sonuçları bölümün ikinci paragrafa bakın) büyük olası…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / EFN için Jeunes Chercheurs), Fondation Voir et oyunsu ve Fondation Bettencourt Schueller (EFN Genç Araştırmacı Hibe), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, EFN için kalıcı pozisyon) tarafından desteklenen ve (SCF için R01-EY13295) Sağlık Ulusal Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü. Ayrıca, Institut de la Vizyon Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique ve bölüm de Paris tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
