Крупномасштабная очистка свинины или крупного рогатого скота наружных сегментов фоторецепторов фагоцитоза Анализы на эпителиальных пигментных клеток сетчатки

В сетчатке, зрение вызвано изомеризации фоточувствительных молекул, называемых опсины, прежде чем преобразован в сигнал, который может быть передан между нейронами до визуальных областей мозга. Эти молекулы встраиваются в штабеля мембранных дисков, напоминающих блины, которые составляют наружный сегмент части клетки фоторецепторов (PRS). Подвергаясь постоянным воздействием света, и поэтому значительного уровня окислительного стресса, ОР постоянно обновлять свои наружные сегменты, чтобы ограничить потенциальный ущерб окислительный. Наружных сегментов фоторецепторов находятся в тесном контакте с апикальной микроворсинки соседних пигментного эпителия (РПЭ) клеток. Клетки ПЭС составляют внешнюю часть крови сетчатки барьер и обеспечить многочисленные задачи, которые имеют решающее значение для здоровья и функции ¹ фоторецепторов, такие как тушение световые лучи с помощью меланина пигментов, повторное изомеризации фотореакционноспособной опсин компонентов сетчатки глаза, обеспечивая питательными веществами и гrowth факторов, участвующих в распоряжении PR метаболита.

Кроме того, клетки ПЭС устраняют провел POS и перерабатывать их компоненты, ежедневный занятие, которое регулируется циркадного ритма в сетчатке млекопитающих ^2,3. Оформление пролитой POS является абсолютно необходимым для выживания PR. Когда он полностью отменены, POS мусору скапливаться и ОР вырождаться приводит к быстрому ^4,5 потере зрения. Если ритмическая профиль теряется и заменяется постоянной деятельности, PR и ПЭС при накоплении дефектов с возрастом ^6. Таким образом, очень важно, чтобы охарактеризовать молекул рный регулирование НПП фагоцитоза в пробирке, чтобы понять, фенотипы, связанные с ее дисфункции. Интересно, что молекулярные машины в клетках ПЭС очень похож на тот, используемой для очистки макрофагов апоптотических клеток, и оба зависят от признания открытой фосфатидилсерина на фагоцитарную мусора ^7-9. Тем не менее, ПЭС клетки и макрофаги регулируют рНagocytosis иначе, как макрофаги выбрать для немедленного устранения апоптоза клеток во время столкновения, а клетки ПЭС ритмично поглотить POS только один раз в день, несмотря на их постоянном контакте с наружным сегментам. Это говорит о том специфические механизмы регуляции, которые еще не полностью изучены.

Многие из молекул, вовлеченных в НПП фагоцитарной техники были идентифицированы или проверены благодаря использованию выделенной POS и клеточных культур фагоцитоза анализов. Рецепторов alphavbeta5 интегрину расположен в НПП поверхности верхней клетки, в координации с его лигандом MFG-E8, специфически связывается с POS ^10-12, которые затем интернализованного через MerTK тирозинкиназы рецептора ^13-15. Поглотитель рецептора CD36, как было показано участие в приеме POS и влиять на его скорость ^16,17, и может служить в качестве датчика окисленных фосфолипидов на поверхности POS ^18. Интернационализация нуждается в наем F-актина цитоскелета задницуociated белки, такие как аннексин 2 ^19, миозина II ²⁰ и миозина VIIA ^21,22. Родной или окисляется POS в пробирке также используются для понимания старения фенотипы клеток RPE в естественных условиях, связанных с накоплением плохо усваиваются окисленного POS ^23-28. Поколение ПЭС клеток, полученных из стволовых клеток инициировал новое приложение для изолированной POS, которые используются, чтобы доказать, функциональность клеток, прежде чем они пересаживаются на животных или больных ^29,30,27.

Впервые описан Molday и коллег в 1987 году ^31, протокол для выделения крупного рогатого скота POS сочетает в себе ультрацентрифуги шаг сетчатки гомогенатах непрерывных градиентов сахарозы с соблюдением характерной оранжевой появления небеленой сетчатки фотопигментом (балансовой 11- цис сетчатки). В последние 10 лет в связи с мерами предосторожности, принятых в целях сведения к минимуму риска коровьего бешенства, использование свиных глазах стала increasingly заметным. Протокол, описанный здесь, показывает, как получить большое количество POS из свиной или бычий глаз, которые могут быть аликвоты и хранили в течение длительных периодов времени. Это устраняет необходимость подготовки POS от грызунов глазами, что требует использования большого количества животных в подготовке POS и анализа ^32,33,21,22. Кроме того, сведения о POS маркировки перед хранением с использованием флуоресцентных молекул даны, чтобы количественно и визуализировать POS в упрощенном и сопоставимым образом для некоторых приложений по сравнению с маркировки POS после фагоцитоза анализа ^32,10. Таким образом, эти большие запасы позволяют воспроизводимости и легкости в использовании во многих различных типах опытов.