Summary

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d'analyse transcriptionnelle

Published: January 12, 2015
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Summary

Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.

Abstract

Le cœur embryonnaire du poisson zèbre est composé de seulement quelques centaines de cellules, qui ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon. Par conséquent, afin d'empêcher le transcriptome cardiaque d'être masqué par le transcriptome embryonnaire mondiale, il est nécessaire de collecter un nombre suffisant de coeurs pour d'autres analyses. En outre, comme le développement cardiaque poisson zèbre se déroule rapidement, collection de coeur et des méthodes d'extraction d'ARN ont besoin d'être rapide afin d'assurer l'homogénéité des échantillons. Ici, nous présentons un protocole de dissection manuelle rapide pour la collecte coeurs fonctionnels / battant à partir d'embryons de poisson zèbre. Ce est une condition essentielle pour l'extraction de l'ARN spécifiquement cardiaque ultérieure pour déterminer les niveaux d'expression de gènes spécifiques cardiaque par analyse du transcriptome, comme quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR). Le procédé est basé sur les propriétés adhésives différentielles du poisson zèbre embryonnaire cœur par rapport à d'autres tissus; ce qui permet pour la PHY rapidela séparation des sique du tissu cardiaque extracardiaque par une combinaison de la perturbation de la force de cisaillement fluidique, la filtration par étapes et la collecte manuelle des transgéniques coeurs marqués par fluorescence.

Introduction

Poisson zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en biologie du développement à étudier l'organogenèse in vivo en raison de son développement embryonnaire rapide, transparente et extra-utérine, combinée avec la petite taille et de la disponibilité de lignes de journaliste transgéniques avec expression tissu-spécifique de protéines fluorescentes. Ce petit vertébré est particulièrement bien adapté pour étudier le développement de coeur parce que l'oxygénation de l'embryon de poisson zèbre début ne repose pas sur du rythme cardiaque et la circulation sanguine; ces caractéristiques ont permis la caractérisation d'un grand nombre de mutants cardiovasculaires 1,2 et le poisson zèbre est maintenant un organisme modèle largement reconnu pour étudier les maladies cardiaques 3.

Pour étudier l'expression des gènes au cours du développement embryonnaire, les transcriptions sont généralement analysées par l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6, ou microarrays séquençage de prochaine génération (ARN-Seq) 7. Tandis queWISH permet une analyse spatio-temporelle de l'expression des gènes dans l'ensemble embryon, les niveaux de transcription sont habituellement évaluée par RT-PCR quantitative, des puces ou des approches d'ARN-Seq. Cependant, ces procédés nécessitent un enrichissement spécifique de tissu pour le profilage de l'expression génique.

Étant donné que le cœur embryonnaire du poisson zèbre ne représente qu'une petite fraction de l'ensemble de l'embryon, les études du transcriptome au cours du développement cardiaque nécessitent un protocole de dissection et l'enrichissement des cœurs. En outre, pour obtenir des données physiologiquement pertinentes, il est important de maintenir le tissu cardiaque entièrement fonctionnel jusqu'à l'extraction d'ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler rapidement physiologiquement normal et le cœur battant de centaines d'embryons de poisson zèbre pour obtenir efficacement des échantillons d'ARN de haute qualité pour des analyses ultérieures. La présente méthode est basée sur le protocole rapporté par Burns et MacRae, 2006 8. Pour l'enrichissement du tissu cardiaque, les deux méthodes utilisent une ligne rapporteur infarctus transgéniqueet de profiter des propriétés d'adhérence différentielle de cœurs embryonnaires de poisson zèbre par rapport aux autres tissus. En bref, par pipetage de nombreux embryons monter et descendre dans une pipette étroite, coeurs sont diffusés simultanément des organismes embryonnaires et ensuite séparés des débris embryonnaire en deux étapes rapides de filtration; coeurs marqués par fluorescence sont ensuite triées manuellement à partir de débris restants et recueillies pour un traitement ultérieur.

Protocol

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de la loi allemande et de l'État de Berlin; la manipulation du poisson zèbre a été contrôlée par l'autorité locale pour la protection des animaux (LaGeSo, Berlin-Brandebourg). 1. Obtenir embryons de poissons zèbres pour l'extraction de coeur Croix journaliste poisson zèbre cardiaque tels que la Tg (myl7: EGFP) twu34 lignée transgénique neuf afin d'obtenir des embryo…

Representative Results

Ici, nous décrivons une expérience coeur de dissection représentant utilisant le poisson zèbre Tg (myl7: GFP) twu34 lignée transgénique neuf, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) exclusivement dans le myocarde (Fig 1.). Nous avons recueilli les deux les cœurs disséqués et les embryons à partir de laquelle ils ont été dérivés pour évaluer la pureté de l'échantillon de coeur. Brièvement, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 poisson zèbre <su…

Discussion

Ce protocole permet l'enrichissement rapide de poisson zèbre tissu cardiaque embryonnaire pour l'expression génique analyse. La quantité et la qualité de l'échantillon d'ARN spécifiquement cardiaque dépend grandement sur quelques étapes cruciales: d'abord, la quantité de l'échantillon est grandement améliorée si la perte de coeurs est empêché à chaque étape du protocole, car la purification de l'ARN ne fonctionnera qu'avec suffisante matière de départ. D'autre part, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Materials

Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1,5ml centrifugation tubes
15ml and 50ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µL in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

References

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Cite This Article
Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

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