転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広くによりサイズが小さく、蛍光タンパク質の組織特異的な発現を有するトランスジェニックレポーターラインの利用可能性と合わせて、高速で透明かつ子宮外胚発生、 インビボでの器官形成を研究するために発生生物学で使用されている。初期のゼブラフィッシュ胚の酸素は、心拍、血流に依存しないので、この小さな脊椎動物は、心臓発生を研究するために特に適している。これらの機能は、心血管の変異体^1,2の多数の特徴付けを可能にしたとゼブラフィッシュは現在、心疾患^3を研究するための広く認識モデル生物である。

胚発生の間の遺伝子発現を研究するために、転写物は一般にホールマウントin situハイブリダイゼーション ^（WISH）4によって分析され、RT-qPCRを^5、マイクロアレイ^6、または次世代シークエンシング（RNA配列^）7。同時にWISHは全体胚内の遺伝子発現の空間的·時間的な分析を可能にする、転写レベルは通常、RT-qPCRを、マイクロアレイまたはRNA-配列アプローチによって評価される。しかしながら、これらの方法は、特異的な遺伝子発現プロファイリングのための組織の濃縮を必要とする。

ゼブラフィッシュ胚の心臓は全体の胚のごく一部を表すので、心臓の開発中にトランスクリプトーム研究は心の解剖と濃縮のためのプロトコルが必要。また、生理学的に関連するデータを得るためには、RNA抽出まで、完全に機能的心臓組織を維持することが重要である。ここでは、急速に生理的に通常の単離及び効率的にさらなる分析のための高品質なRNAサンプルを得るために、ゼブラフィッシュの胚の数百人から心を打つためのプロトコルを記述します。本発明の方法は、バーンズとマクレー、2006年⁸によって報告されたプロトコルに基づいています。心臓組織の充実のために、両方の方法は、トランスジェニック心筋のレポーターラインを使用する他の組織に対するゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性を利用する。簡単に言えば、狭いピペットチップを通して上下に多くの胚をピペッティングすることにより、心臓を同時に胚の体から解放され、その後、2急速ろ過段階で胚の破片から分離。蛍光標識した心は、手動で残りの破片から選別し、さらなる処理のために収集されます。