Summary

Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Published: February 18, 2014
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Summary

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Abstract

Descreve-se o uso de bio-camada de interferometria para estudar interacções inibidoras de subunidade ε com o complexo catalítico de Escherichia coli ATP sintase. Bacteriana tipo F ATP sintase é o alvo de um novo antibiótico, aprovado pela FDA para combater a tuberculose resistente a medicamentos. Compreender bactérias específicas auto-inibição da sintase do ATP pelo domínio C-terminal da subunidade ε poderia proporcionar um novo meio para a enzima alvo para a descoberta de medicamentos anti-bacterianos. O domínio C-terminal de ε sofre uma alteração conformacional dramática quando as transições de enzimas entre os estados activos e inactivos, e ligandos do local catalítico, que podem influenciar de conformações de ε é predominante. As medidas do ensaio de cinética de ε ligação / dissociação com o complexo catalítico, e indiretamente meamede a mudança de ε ligado a enzima para e a partir da conformação inibitória aparentemente nondissociable. O sinal de interferometria Bio-camada não é muito sensível para a composição da solução, de modo que também pode ser utilizado para monitorizar os efeitos alostéricos de ligandos do local catalítico de alterações conformacionais do ε.

Introduction

Interacções proteína-proteína são importantes para muitos processos biológicos, e métodos ópticos livre do rótulo como a superfície Plasmon Resonance (SPR) têm sido utilizados in vitro para estudar a cinética de ligação e de dissociação 1. A maioria dos métodos sem rótulo imobilizar uma biomolécula em uma superfície do sensor e usar um sinal óptico para detectar um parceiro de ligação de solução, uma vez que se associa com a biomolécula imobilizada 1. Enquanto SPR é um método altamente sensível, é propenso a interferências devido a mudanças no índice de refração da solução que flui sobre o sensor 2. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, Bio-camada Interferometria (BLI) é menos afetado por mudanças na composição da amostra 1,3. BLI usa biossensores de fibra óptica que têm um revestimento biocompatível proprietária na ponta. O sistema utilizado aqui (Octeto-RED96) contém oito espectrofotômetros. A luz branca é canalizada para uma linha de sondas que se movem em um braço robótico. Sensores de fibra óptica are captado pelas sondas e mudou-se para uma placa de 96 poços contendo amostras. Uma das moléculas alvo é imobilizado na superfície do biossensor. Em seguida, os sensores são movidos para cavidades contendo o parceiro de ligação em solução. BLI monitora associação do parceiro de ligação com a molécula imobilizada e depois monitora dissociação depois de se mudar os sensores de solução sem o parceiro de ligação. A ligação de moléculas de superfície do biossensor leva a alterações na interferência óptica entre ondas de luz que reflectem para trás para os espectrofotómetros a partir de uma superfície interna e externa a partir da interface entre o sensor e solução. Estas alterações na interferência pode ser quantificado e utilizado para determinar as taxas cinéticas de ligação e de dissociação, tal como resumido na animação da figura 1.

Temos aplicado BLI para medir as interacções entre o complexo catalítico da ATP sintase bacteriana e sua subunidade ε, o qual pode auto-inibir a enzima. ATP synthase é um nanomotor rotativo encaixado à membrana que catalisa a síntese e hidrólise de ATP 4. O complexo catalítico (F 1) pode ser isolado de uma forma solúvel que funciona como uma ATPase. Subunidade ε tem dois domínios: o domínio N-terminal (NTD) é necessário para a montagem correcta e acoplamento funcional da enzima, mas não interagem directamente com as subunidades catalíticas; do domínio C-terminal (CTD) pode inibir a enzima, interagindo com várias subunidades catalíticas 5,6. Esta regulação mediada por ε é específico para ATP sintases bacterianas e não se observa no homólogo mitocondrial. ATP sintase emergiu como um alvo para drogas antibacterianas, como mostrado pela recente aprovação do FDA bedaquiline no tratamento da tuberculose resistente aos medicamentos 7. Assim, visando papel inibitório da ε para a descoberta da droga poderia render antibacterianos que não inibem a ATP sintase mitocondrial. Com o complexo catalítico isolado (F 1), εtorna-se uma subunidade dissociáveis. No entanto, com ε ligado a M 1, o εCTD pode sofrer uma alteração conformacional dramática, parcialmente inserção na cavidade central da enzima e formando um estado de inibição, que é pouco provável que se dissociam directamente 6,8. Usamos BLI para medir cinética de F 1 / ε ligação e dissociação, e indiretamente, para examinar os efeitos alostéricos do local catalítico ligantes na conformação de ε.

No nosso sistema, ε foi escolhido para a imobilização na superfície do sensor, uma vez sinal BLI (como SPR) é sensível à massa das moléculas de ligação à superfície. A subunidade ε é pequena (~ 15 kDa), em relação ao principal complexo F 1 (~ 347 kDa). Assim, um sinal de BLI maior irá resultar da ligação de F 1 a ε imobilizada. A fim de monitorar F 1 de dissociação, o que pode ser muito lenta, ε deve ser fortemente imobilizada. Assim, optou-se por biotinilarE imobilizá-la em biossensores revestidas com estreptavidina. As proteínas podem ser biotinilada por (i) a modificação aleatória de lisinas da superfície 9, (ii) a reacção de uma cisteína nativa única ou engenharia com um reagente biotina-maleimida de 10 ou (iii) a adição de um péptido geneticamente biotina-receptor específico que é enzimaticamente biotinilado durante expressão in vivo da proteína marcada 11. No nosso sistema, ε é biotinilado utilizando método (iii) 8. Uma vez ε marcado com biotina, está imobilizado sobre sensores estreptavidina, BLI pode medir a ligação e dissociação do F 1 que foi esvaziada da subunidade ε (F 1 (-ε)). Para as experiências aqui descritas, os ensaios preliminares foram feitos para determinar quantidades razoáveis ​​de proteína biotinilada para imobilizar sobre os sensores. Isto pode variar, dependendo do peso molecular da proteína e do seu parceiro de ligação, mas o objectivo é o de determinar uma quantidade mínima de proteína imobilizada tchapéu fornece (i) aceitável sinal-ruído para a cinética de ligação com uma baixa concentração do parceiro de ligação (abaixo K D) e (ii) uma distorção mínima de cinética de ligação com a concentração de quase saturação do parceiro de ligação. Além disso, a estequiometria de biotinilação pode variar (mas evitar> 1 mol biotina / proteína mol), de modo algum ensaio inicial pode ser necessário para cada novo lote de proteína biotinilada para confirmar que um sinal consistente BLI pode ser alcançada durante a imobilização da estreptavidina-revestida sensores.

Protocol

1. Programação do Instrumento de BLI Assay Ligue o instrumento pelo menos uma hora de antecedência para permitir que a lâmpada para aquecer, o que é necessário para minimizar o ruído e deriva em sinal óptico durante o experimento. Regule a temperatura desejada por meio da guia instrumento para pré-aquecimento do suporte da placa de amostra. Em seguida, criar o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione "New Kinetics Experiment" na guia Assisten…

Representative Results

Ligação em tempo real e da cinética de dissociação BLI são mostrados na Figura 3. Esta experiência foi feita com tampão de ensaio de associação e dissociação. Esta experiência foi iniciada com um passo da linha de base de 10 minutos uma vez que os sensores foram prewet apenas brevemente. Em seguida, ε biotinilado foi carregado sobre os sensores. No dissociação detectável de ε ocorreu em todas as etapas restantes, como visto a partir da curva de referência (G) que não tinha parceiro d…

Discussion

Instrumentos actualmente disponíveis para BLI permitir a produção e flexibilidade significativa nos ensaios para interacções biomoleculares. Várias amostras de solução são dispensados ​​em poços de uma placa de microtitulação preto, e um conjunto de sensores BLI paralelas são programados para se mover para trás e para a frente entre as colunas de poços na placa. As amostras são agitadas por agitação orbital durante todo o ensaio. O sistema utilizado aqui tem oito sensores e usa uma placa de amostra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos FortéBio para fornecer gráficos utilizados na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM083088 para DTM

Materials

Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Bovine Serum Albumin Sigma A6003-10G Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019 Tray of 96 sensors
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209 Black, Polypropylene
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 6.4 Newer versions available
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 6.4 Newer versions available

References

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Cite This Article
Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383, doi:10.3791/51383 (2014).

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